Aksonlar, Dendrit ve Beyin Dilimleri Bireysel Nöron Dendritik Spine kaynaklanan voltaj duyarlı Boya Kaydı

Tanımlanan deneylerin genel amacı, bireysel bir sinir hücresinin membran potansiyeli sinyal entegrasyonunu ve bilgi işlemesini, bir nöron üzerindeki birden fazla bölgeden mikrometre altı ve milisaniye altı çözünürlükle optik olarak izlemektir. Bu, öncelikle membran potansiyeli geçişine karşılık gelen ışık yoğunluğundaki küçük kesirli değişimlerin kaydedilmesine izin verecek uygun hassasiyette bir görüntüleme düzeneği kurularak gerçekleştirilir. Ardından, etkili görüntüleme için uygun anatomiye sahip nöronlar, yani kesit yüzeyine yakın tek bir odak düzleminde uzun ve sağlam uzantıları olan nöronlar seçilir.

Ardından, membran potansiyeli değişimlerinin optik olarak izlenebilmesi için önceden seçilen nöronları voltaj duyarlı boyalarla yükleyin. Sonuçlar, aksonlardan, dendritlerden ve dendritik dikenlerden gelen membran potansiyeli sinyallerini izleyerek, tekil sinir hücreleri tarafından gerçekleştirilen elektriksel sinyal entegrasyonu hakkında bilgi edinmede bu yaklaşımın sahip olduğu benzersiz yeteneği göstermektedir. Hücresel nörofizyolojide.

Konvansiyonel elektrofizyolojinin iki uzun süreli kısıtlaması olan elektrot ölçümlerinin düşük uzaysal çözünürlüğü ve akson kollateralleri veya dendritik dikenler gibi küçük yapılardan kayıt yapamama durumu nedeniyle yeni araçlar geliştirilmektedir. Bu dezavantajların üstesinden gelmek için, patch elektrot yaklaşımı, bir nöronun tüm bölümlerinden paralel kayıtlar yapılmasına izin veren optik tekniklerle birleştirilebilir. Burada böyle bir tekniği, tek diken çözünürlüğünde membran potansiyel geçişlerinin çoklu yan optik kaydını tanımlıyoruz.

Bu deneyde, homojen aydınlatmayı ayarlamak için dik bir mikroskop ve üç kamera kullanılır. İlk olarak, lazer ışını yoluna uygun bir nötr yoğunluk filtresi yerleştirin. Ardından, objektifi standart floresan lamın yüzeyine odaklayın.

Görüş alanının CCD görüntüsü monitör ekranından izlenirken, görüş alanının merkezlenmiş ve homojen bir şekilde aydınlatılmasını sağlamak için epi floresan kondansatör üzerindeki uygun aktüatörler kullanılarak kuvars ışık kılavuzunun alıcı ucunun ve ışık kılavuzunun çıkış ucunun konumu ayarlanır. Vibrasyon gürültüsünü belirlemek için, yüzeyinde floresan olmayan bir işaret bulunan standart bir floresan lam kullanın. Işık yoğunluğu, neuro CCD ile sürekli modda kaydedilir.

Objektifi siyah işaretin karanlık bir kenarına odaklayın ve 2 kHz kare hızında yaklaşık 100 milisaniye boyunca ışık yoğunluğunu kaydedin. Ardından, homojen şekilde aydınlatılmış alandan ışık alan yaklaşık 20 pikselden ve siyah işaretin kenarı boyunca yer alan yaklaşık 20 pikselden elde edilen fraksiyonal ışık yoğunluğu izlerinin uzamsal ortalamasını görüntüleyin. Yüksek kontrastlı kenarlara sahip piksellerden gelen uzamsal ortalamadaki fazla gürültü, sistemdeki vibrasyonel gürültüyü yansıtır.

Deklanşör açılışının optik kayıtta titreşimsel gürültüye yol açmaması için mekanik deklanşörün titreşim izolasyon masasının dışında monte edilmesi esastır. Bu kritik bir adımdır. Optik kayıt sistemi tarafından algılanabilecek akustik titreşim gürültüsünü azaltmak için deklanşörü plastik vidalar ve titreşim izolasyon malzemesi kullanarak monte edin.

Titreşimi izole etmek için, görüntünün keskin kenarını kapsayan piksellerin titreşim gürültüsü shot gürültüsünden daha küçük olana kadar titreşim izolasyon masasını ayarlayın. Mekanik titreşimlerin mikroskop gövdesine iletilmesini önlemek için masa üzerindeki ekipman kabloları gevşek bırakılmalıdır. Bu prosedürde, spinning disc konfokal sistem ile ilgi duyulan bireysel sinir hücrelerinde EGFP eksprese eden bir fare hattı kullanılarak, standart prosedürlere uygun 300 ila 400 mikron kalınlığında beyin dilimleri hazırlayın.

Kesitteki EGFP etiketli nöronları görselleştirin. Ardından, membran potansiyeli görüntülemesi için dendritik aksonal ağaçları sağlam olan ve uzantıları kesit yüzeyine paralel ve yakın seyreden nöronları seçin. Daha sonra, yaklaşık 15 saniye boyunca negatif basınç uygulayarak cam patch pipetini ucundan başlayarak boyasının olmadığı hücre içi solüsyonla elektrot konik kısmının üçte ikisine kadar doldurun.

Ardından, elektrodu, hücre içi çözeltide çözünmüş membran IMP permeate voltaja duyarlı boya içeren çözelti ile geri doldurun. Boyayı elektroda yükledikten sonraki bir dakika içinde, önceden seçilmiş bir nöronu patch yapın. Pipet banyoya indirilmeden önce yaklaşık 10 milimetre cıva kadar düşük pozitif basınç uygulayın; elektrot kesit içerisinde konumlandırılırken bu işlem, sızdırmazlık sağlanmadan önce elektrottan boya sızmamasını sağlar.

Elektrot hücre yüzeyine temas etmeden hemen önce basıncı 100 mm Hg civarına yükseltin. Tüm hücre konfigürasyonunda sızdırmazlık sağlandıktan sonra, boyanın somatik patch pipetinden somaya serbest difüzyonuna 20 ila 45 dakika boyunca izin verin. Boya difüzyonu sırasında, akım kenetleme (current clamp) modunda uyarılmış aksiyon potansiyellerini kaydederek nöronun fizyolojik durumunu izleyin.

Ek olarak, hücre somasından gelen dinlenme ışık yoğunluğunu iki kilohertz kare hızında ve nötr yoğunluk filtreleri ile ayarlanan tam ışık yoğunluğunun bir kısmında kaydederek boyama miktarını izleyin. Aksiyon potansiyeli genişlemeye başlayana kadar indirme işlemine devam edin. Boyama sonunda, tüm hücreden dışa dönük yamama (outside out patch) konfigürasyonuna geçişin gerçekleştiğinden emin olmak için yamama pipetini voltaj klembi konfigürasyonunda somadan dikkatlice uzaklaştırın.

Ardından, voltaj duyarlı boyanın nöronal uzantılara yayılmasına izin vermek için kesiti oda sıcaklığında 1,5 ila iki saat daha inkübe edin. Boyanın önemli bir kısmı somadan dendritik ve aksonal uzantılara difüzyonla yayıldıktan sonra, aksiyon potansiyelinin dalga formu tamamen geri kazanılmış olmalıdır. Bir sonraki adımda, düşük yoğunluklu floresan altında boyalı nöronun somasını bulun.

XY tablası kullanarak ilgi duyulan nesneyi görüntülemek için gereken minimum seviyeye kadar ışık yoğunluğunu nötr yoğunluk filtreleri ile azaltın. Floresan soma tanımlanana kadar, floresan nöronu içeren kesit alanını tarayın. Boyanmış hücrenin somasını mikroskop alanının merkezine konumlandırın; DIC altında, boya içermeyen standart bir patch elektrot ile nörona patch uygulayın. Ardından, voltaj görüntüleme için CCD'nin sürekli kayıt modunda, 10 ila 40 hertz kare hızında, düşük yoğunluklu floresan altında nöronal çıkıntıları görüntüleyin.

Bir XY sahne konumu kullanarak, görüntüleme alanının ortasındaki ilgili nöronal uzantıyı hedefleyin. Ayrıca, fotodinamik hasarı azaltmak için mikroskobun kısmen kapatılmış alan durdurucu irisini kullanarak SOMA'yı eksitasyon ışığından koruyun. Ardından, bireysel dendritik dallardaki geri yayılan aksiyon potansiyelleri ile ilişkili optik sinyalleri kaydedin.

Ardından aksonlardaki aksiyon potansiyelleriyle ilişkili optik sinyalleri kaydedin. Bundan sonra, dendritik dikenlerdeki geri yayılan aksiyon potansiyelleriyle ilişkili optik sinyalleri kaydedin. Sinyal dalga formunun doğru yeniden yapılandırılması için uygun kare hızını kullanın.

Aynı zamanda, boya ağarmasını ve fotodinamik hasarı minimize etmek için kayıt sürelerini ve yüksek yoğunluklu uyarım ışığına maruz kalma süresini mümkün olduğunca kısa tutun. Optik sinyallerin kaydı burada gösterilmektedir. Burada, üst panelde, aksonu kayıt konumunda olan boyanmış bir nöronun yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüsü gösterilmektedir.

Orta panel, membran potansiyeli görüntüleme için kullanılan CCD ile elde edilen aksonun düşük uzamsal çözünürlüklü floresan görüntüsünü gösterirken, alt panel soma'dan alınan elektrot kayıtlarını, A IS ve rvi düğümünden alınan optik kayıtları sunmaktadır. Ham veriler ve işlenmiş sinyaller gösterilmiştir. Bu şekil, voltaja duyarlı boya yüklü bir L beş kortikal nöronun aksonundan gelen aksiyon potansiyeli sinyallerini göstermektedir.

Potansiyel ilişkili sinyaller 10 kilohertz kare hızında kaydedilmiştir. Bu izler, üç farklı konumdan gelen aksiyon potansiyeli geçişlerini göstermektedir. Birincisi, somadan kayıt yapan elektrottur.

İkincisi, akson tepesinden alınan optik kayıtlar ve üçüncüsü, vie'nin ilk notundan alınan optik kayıt; burada aynı üç konumdan alınan üst üste bindirilmiş sinyaller yer almaktadır. Bu şekil, 100 hertz'deki kısa depolarizan akım darbeleriyle başlatılan, bir L 5 kortikal nöronun dendritik ağacındaki birden fazla konumdan gelen dört adet geri yayılan aksiyon potansiyeli sinyali patlamasını göstermektedir. Burada, tek bir dendritik dikenden gelen aksiyon potansiyeli sinyalleri gösterilmiştir.

Burada dönen disk konfokal görüntü yığınından elde edilen anatomik rekonstrüksiyon ve burada CCD kamera ile elde edilen aynı bölgenin floresan görüntüsü yer almaktadır. Membran potansiyeli görüntülemesi için, CCD görüntüsü üzerinde belirtilen bir ile üç arasındaki konumlardan gelen geri yayılan aksiyon potansiyellerine karşılık gelen floresan yoğunluk izleri sağ panelde gösterilmiştir. En alttaki iz, somadan alınan elektrot kaydını göstermektedir.

Kayıt öncesi hazırlık, zarın distal çıkıntılara yayılması için gereken bekleme süresi dahil olmak üzere yaklaşık üç saat sürer. Kayıt süresi, preparatın normal azalması ve PO fotodinamik hasarı ile sınırlıdır. Fotodinamik hasarın miktarı, uyarım ışığı şiddetinin yanı sıra bireysel kayıt denemelerinin süresi ve sayısıyla orantılıdır.

Bazı deneylerde, bir veya iki saat boyunca 50'den fazla kayıt denemesi gerçekleştirmek mümkündür. Diğer ölçümler ise yüksek eksitasyon, ışık yoğunlukları ve daha uzun süreli kayıtlar gerektirir ve fotodinamik hasar nedeniyle yalnızca birkaç kayıt denemesiyle sınırlıdır. Bu videoyu izledikten sonra, beyin kesitlerindeki bireysel nöronların tüm aksonal ve dendritik yapılarından voltaj görüntülemesinin nasıl gerçekleştirileceği konusunda kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız.