Eşzamanlı Elektroensefalografi, Kemirgen Serebral Korteks Laktat Konsantrasyonu ve Nöronal Faaliyet Optogenetic Manipülasyon Gerçek zamanlı ölçüm

Bu prosedürün genel amacı, hassas stereotaksik koordinatlarda optogenetik stimülasyon sırasında EEG ile tanımlanan uykuyu ve laktat konsantrasyonunu ölçmektir. Gerekli elektroensefalografik leadleri ve laktat sensörü ile fiber optik kablo için kanülleri cerrahi olarak implante edin. Ardından, fiber optik kabloyu ve önceden kalibre edilmiş laktat sensörünü hayvanın kafatasındaki kılavuz kanüllerine yerleştirin.

Ardından, istenen elektrofizyolojik yanıtı elde etmek için mavi ışık stimülasyon yoğunluğunu ayarlayın. Daha sonra, hayvanın kendiliğinden davranmasına ve/veya uyumasına izin verilirken elektroensefalografik, elektromiyografik ve laktat konsantrasyon verilerini toplamaya geçin. EEG'nin farmakolojik çalışmaları gibi diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu deneysel yaklaşım, nöron aktivitesi saniyenin altında bir zaman ölçeğinde gerçek zamanlı olarak manipüle edilirken beyin biyokimyasını ve elektrofizyolojisini izleme avantajına sahiptir.

Dolayısıyla, uyku araştırmaları alanı için yeni içgörüler sağlama potansiyeli yüksektir. Örneğin, yavaş dalga uykusunun metabolik ve elektrofizyolojik eşlikçileri tanımlanabilir. Bu tür bir deney; öğrenme ve bellek, sinaptik plastisite veya nöbet bozuklukları gibi nörobilimin diğer alanlarına da uygulanabilir.

Cerrahi teknik teknik olarak zorlayıcıdır. Önemli ölçüde el becerisi gerektirir, ancak bu durum pratik yaparak kazanılabilir. Bu görsel gösterimde, yazılı açıklamayı tamamlayacak şekilde, bazı karmaşık cerrahi prosedürlerin kritik adımlarını tekrarlayacağım.

Hayvan cerrahi işlemden sonra iyileştiğinde, asıl zorluk laktat sensörünü ve fiber optik kabloyu düzgün bir şekilde yerleştirmektir. Jonathan ve ben, bu iki hassas ekipmanı yerleştirmek için hayvanı sabitlerken nasıl kararlı bir tutuş sergileneceğini göstereceğiz. Son olarak, stimülasyon şiddetini gerçek zamanlı olarak ayarlayarak EEG yanıtının nasıl optimize edileceğini göstereceğiz.

Bu deney için, mavi ışığa duyarlı katyon kanalını eksprese eden transgenik fareler kullanın. Kanal, serebral kortikal nöronlarda yerleşir. Öncelikle, indüksiyon için %5 isoflurane ve %95 oksijen kullanarak fareyi anesteziye alın ve ardından %3 isoflurane ve %97 oksijen ile anestezinin devamlılığını sağlayın.

Gözlerin arasından kafatasının arkasına doğru, kafatasının üst kısmında medial bir insizyon yapın. Kafatasını hidrojen peroksit ve steril salin ile temizleyin. Elektrot optogenetik stimülasyon konfigürasyonları için stereotaksik koordinatları belirlemek amacıyla Bregma ve Lambda noktalarını bulun ve işaretleyin; önce 0,5 mm'lik bir küre frez uç, ardından 0,7 mm'lik bir küre frez uç içeren yüksek hızlı bir dental matkap ile vida deliklerini hazırlayın.

Elektrot kelo gram vidalarını yivli bir el tornavidası ile deliklere yerleştirin. İstenen derinliği elde etmek için vidaları yaklaşık dört ila beş tur döndürerek sıkın. Kılavuz kanülleri stereotaktik bir kanül ile yerinde tutun ve ardından akrilik çimento ile kafatasına ve ankrajlara sabitleyin. Açıklığı korumak için her kılavuz kanül, cerrahi anından deney anına kadar bir dummy kanül veya stilet içermelidir.

EEG'ler ve kılavuz kanüller kafatasına yerleştirildikten sonra, bunları ince bir tabaka dental akrilik çimento ile birbirine sabitleyin. Çimento donduktan sonra, plastik konnektörü kurumuş çimento tepesinin üzerine yerleştirin; EEG iletkenlerinden çıkan tellerin uçlarını, tellerin çimento içinde kalma ihtimaline karşı plastik konnektördeki kontaklara lehimleyin. Ardından, elektromiyogram tellerini 21 gauge bir iğnenin gövdesinden kaydırarak geçirip kaslara doğru çekin.

Kas dokusundan geçirilerek, tellerin kastan çıktığı noktanın hemen distalinden 5-0 naylon sütür ile çift cerrahi düğüm atın. Kas dokusuna erişmek için ekartasyon yapılan cildi, ters kesen P3 iğne ve 5-0 naylon sütür kullanarak tekli interrupte cerrahi düğümlerle tekrar dikin. MC stimülasyon ünitesi programlandıktan sonra, cihazı 5 V binary açık-kapalı sinyal üreten bağımsız bir sinyal jeneratörü olarak çalıştırın. MC stimülasyon ünitesini BNC konnektörler aracılığıyla lazerin TTL destekli güç ünitesine bağlayın.

Lazer güç ünitesini bir şerit kablo aracılığıyla lazere bağlayın. Ayrıca lazeri, başlangıç fiber optik ara kablosundaki erkek FC konnektörüne bağlayın. Başlangıç fiber optik kablosunu döner ekleme bağlayın.

Komütatör Fiber optik döner eklem, bir komütatör görevi görür. Hayvan kafesi içerisinde hareket ettikçe, döner eklem, dönme torku nedeniyle fiber optik kabloların kopmasını önlemek için döner. Plastik kablo bağları kullanarak komütatörü, hayvanın bulunduğu silindirik kafesin üzerine yerleştirilmiş metal bir standa sabitleyin.

Fareyi, bir elin avuç içini kubbe şeklinde kullanarak altına sabitleyip zapt edin. Başı, deneycinin orta ve işaret parmağı arasına yönlendirin. Ardından, steril 25 gauge bir iğne kullanarak kılavuz kanülü kalıntılardan temizleyin.

Ardından fiber optik kabloyu elle yerleştirin ve vidalı bir kapakla fiber optik kılavuz kanülüne sabitleyin. Fiber optik kablonun beyne yerleştirilme derinliğini, düz kesilmiş uçtan sabit bir mesafeye bağlanan bir sütür düğümü ile kontrol edin. Sensör, fosfat tamponlu salin içerisinde dengelenir ve kademeli olarak üç farklı L laktat konsantrasyonuna maruz bırakılır.

Üretici protokollerine uygun olarak, önceden kalibre edilmiş sensörü, fiber optik kablo yerleştirme prosedürüyle aynı şekilde kafatasına monte edilmiş laktat kılavuz kanülüne yerleştirin. Laktat sensörünü, bipolar fiş konnektörleri kullanarak pinnacle 8, 400 biyosensörünün ön yükselticine bağlayın. Ardından bu ön yükselticiyi, cerrahi olarak implant edilen baş aparatındaki sekiz pinli konnektöre takın.

Verileri toplamadan önce, optogenetik stimülasyonun yoğunluğunu ayarlamak için lazer yoğunluk kontrol düğmesini kullanın. EEG yanıtının genliği, sistematik olarak çalışılmamış faktörler nedeniyle hayvanlar arasında farklılık gösterecektir. Bu nedenle, optogenetik stimülasyonun yoğunluğunu ayarlamak ve istenen yanıt elde edildiğinde EEG yanıtının yeterli olduğunu doğrulamak gereklidir.

Verileri, nöro skor ile birlikte Pinnacle 8, 400 sistemi kullanarak toplayın. Bir SEIA arayüzü, EEG ve EMG veri işleme sürecinin görsel incelemesiyle uyku durumlarını sınıflandırır. EEG ve EMG'ye dayanarak on saniyelik dönemlerdeki veriler; uyanıklık, hızlı göz hareketi dışı uyku veya hızlı göz hareketi uykusu olarak sınıflandırılır.

Bu biyosensör optogenetik stimülasyon konfigürasyonu, cerrahi olarak implante edilmiş EEG elektrotlarını, laktat sensörünü ve optogenetik stimülasyon için kanülü göstermektedir. Optogenetik stimülasyonun yokluğunda, bu fare spontan uyku sürecine girmiştir. E-E-G-E-M-G ve serebral laktat konsantrasyonu sürekli olarak izlenirken uyanıklık hali geçişleri, uyanıklık ve uykunun iki alt tipi belirlenmiştir.

Hızlı göz hareketleri ve hızlı olmayan göz hareketleri, EEG ve EMG'ye dayanarak tanımlanır. İlginç bir şekilde, laktat biyosensörü akımı düşük genlikli EEG'nin bir fonksiyonu olarak yükselmekte ve yüksek genlikli EEG'nin bir fonksiyonu olarak düşmektedir. EEG'nin her iki kanalı da frontal kortekse iletilen optogenetik stimülasyonlara yanıt vermektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, eş zamanlı optogenetik manipülasyon ile beyindeki elektroensefalogram, elektromiyogram ve laktat konsantrasyonu ölçümü için fareye nasıl cerrahi implant uygulanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Uzmanlaşıldığında, bu cerrahi teknik 90 ila 120 dakika içinde uygun şekilde gerçekleştirilebilir. Anestezi derinliğinin bir göstergesi olarak hayvanın solunumunu sürekli olarak izlemeyi unutmayın.

Hayvan her dört ila beş saniyede birden daha az nefes alıyorsa, anestezi çok derin olabilir. Hayvan her iki saniyede birden daha sık nefes alıyorsa, anestezi çok hafif olabilir. Gaz anestezik ajan isofluorine kullanırken uygun güvenlik önlemlerini almayı unutmayın.

Optogenetik stimülasyon için kullanılan lazerden retinanızı korumak için cerrahi odada yeterli havalandırma sağladığınızdan emin olun. Koruyucu gözlük takın veya hayvanı ışık geçirmeyen bir kabine yerleştirin. Laktat biyosensörü ve fiber optik kablonun implantasyonunu tamamen uyanık bir fare üzerinde pratik yapmanız önerilir.

Fareler bu prosedürlere uyum sağlamazlar ve sabitlenmeleri gerekir. Ancak, sabitleme işlemi hayvana zarar verecek veya solunumu engelleyecek kadar zorlayıcı olmamalıdır.