In iştahlı İlişkilendirilebilir Olfaktör Öğrenme

Bu prosedürün amacı, yüksek beyin fonksiyonlarını analiz etmektir. Basit bir model olan DFA larvalarında, iştah aracılığıyla ilişkisel koku öğrenimi incelenmektedir. Bu işlem, öncelikle bir besin şişesinden beslenen 30 adet üçüncü instar larvanın toplanmasıyla gerçekleştirilir.

Ardından, larvalar bir Petri kabında, ödül olarak fruktoz ve her iki yanda olfaktör stimülüs olarak bir adet oktanol içeren koku kapları ile beş dakika boyunca eğitilir. Daha sonra, fruktoz ödülünün olmadığı ve her iki yandaki koku kaplarının amil asetat içerdiği beş dakikalık ikinci bir eğitim aşaması gerçekleştirilir. İki eğitim aşamasının üç kez tekrarlanmasının ardından, larvalar ödül olmaksızın beş dakikalık bir test için karşıt yönlerdeki koku kaplarına maruz bırakılır.

Nihayetinde, bir oktalın Amal asetat karşısındaki göreceli koku tercihi, drosophila larvalarının koku uyaranları ile şeker ödülü arasında bir ilişki kurabildiğini göstermektedir ve bu durum, genetik olarak esnek bir sistemde çağrışımsal öğrenmenin incelenmesi için kullanılabilir. Bu yöntemin, nöral fonksiyonun genetik etkileşimi ile kombinasyonu; ödülü sinyalleyen nöronların neler olduğu veya tekrarlayan bir anının edinilmesi veya geri çağrılması için hangi nöronların gerekli veya yeterli olduğu gibi öğrenme ve bellek alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Prosedürün gösterilmesi anti a postop olacaktır.

Laboratuvarımdaki bir doktora öğrencisi önce fruktoz içermeyen %2,5'lik aros Petri kapları hazırlar. Fruktozlu kapları hazırlamak için, çözünmüş aros'a fruktozu ekleyin ve ardından plakaya dökün. Daha sonra, deneyi gerçekleştiren kişinin körlemesini sağlamak için bu kapların her birini farklı bir sembolle etiketleyin.

Fruktoz içeren kap koşullandırma ödülüdür ve sade kap ise ödül olmayan kaptır. Koşullandırma uyaranları için, 10 µL saf 1-oktan içeren toplam üç adet özelleştirilmiş Teflon koku kabı hazırlayın. Kapaklarda, kokunun buharlaşmasına izin veren küçük delikler bulunmaktadır.

İkinci olarak, parafin yağı ile 1'e 50 oranında seyreltilmiş 10 microliters amil asetat içeren üç koku kabı daha hazırlayın. Bu seyreltme, 10 microliters saf oktan kadar çekicidir; beslenen ancak gezmeyen 30 adet örneğin bir besleme tüpünden toplanmasıyla başlayın. Üçüncü olarak,

Bu protokol günün herhangi bir saatinde uygulanabilir. Sirkadiyen ritimlerden bağımsızdır. Larvaları birkaç damla musluk suyu içeren bir Petri kabına aktarın ve bir fırça yardımıyla dikkatlice ileri geri hareket ettirin.

Ardından larvaları, içinde birkaç damla musluk suyu bulunan ikinci bir Petri kabına aktarın. Larvaların vücut duvarlarında besin macunu olup olmadığını kontrol edin. Şimdi, larvaların kokuları belirli bir şeker ipucuyla ilişkilendirmelerini sağlamak amacıyla Petri kabını deneysel düzeneğe yerleştirin.

Kullanılan uyaranların iki tip kabından birinin sol ve sağ tarafına birer koku kabı yerleştirin. Burada bir oktal kullanılmıştır, ancak deneyci ödül konusunda kör olduğu için bu seçim rastgeledir. Ardından, larva grubunu kabın ortasına yerleştirin.

Kapağı kapatın ve hayvanlar uyaranlara maruz kalırken beş dakika bekleyin. Larvaların su damlacığının yüzey gerilimini yenileyebildiğinden, böylece hapsolmadıklarından ve serbestçe keşif yapabildiklerinden emin olun. Yeni bir Petri kabına yeni bir Amel asetat kabı yerleştirin.

Beş dakika sonra, larvaları sol ve sağ taraflarında zıt uyaranların bulunduğu karşı tip kaptaki yere aktarmak için nemli bir fırça kullanın. Buradaki koku amil asetattır. Larvalar aktarıldıktan sonra kapağı kapatın ve hayvanların beş dakika boyunca keşfetmelerine izin verin.

Bu süre dolduğunda, eğitimin ilk turu tamamlanmış olur. Eğitimin sonraki iki turunu da ilkiyle aynı şekilde gerçekleştirin. Hayvanları nemli bir fırça yardımıyla taşıyarak her bir stimülasyon ve ödül kombinasyonuna toplamda üç kez maruz bırakın.

Deney test alanı için, her bir stimülustan birer tane olacak şekilde taze koku kaplarını, kaplamasız agroz içeren bir Petri kabının karşılıklı bölgelerine yerleştirin. Eğitilmiş hayvanları kabın ortasına aktarın. Kapağı kapatın ve beş dakika bekleyin.

Beş dakika sonra, kabın altında sol, sağ ve orta olmak üzere üç bölgeyi net bir şekilde belirleyen bir şablon kullanarak her bölgedeki larva sayısını sayın. Orta bölge, tercihsizlik puanı olarak kabul edilir ve analizi daha kısıtlayıcı hale getirerek yanlılığa karşı daha az duyarlı kılar. Son olarak, deneyi tamamlamak için, besleme aşamasındaki 30 yeni üçüncü instarla seçin ve eğitim ile test işlemlerini, ödül ve uyaranların ters kombinasyonu ile tekrarlayın.

Aynı koku kaplarını kullanmaya devam edin. Transgenik hayvanların ödül stimülasyonları için normal koku işleme yeteneğine sahip olup olmadığını belirlemek amacıyla birkaç kontrol testi gereklidir. Saf koku tercihi testi, eğitim ve test aşamalarında yapıldığı gibi 30 larvanın toplanması ve yıkanmasıyla başlar.

Ardından, larvaları tek bir tarafında sadece bir uyaran tüpü bulunan agaroz besiyerli bir Petri kabına yerleştirin. Kapağı kapatın ve beş dakika bekleyin. Sonrasında, şablonu kullanarak, uyaranla karşılaştırıldığında kabın yakın tarafındaki, ortasındaki ve uzak tarafındaki larva sayılarını sayın.

Saf şeker tercihini test etmek için deneyde kullanılan her bir uyaran için bu testi gerçekleştirin. Bir petri kabındaki agarın yarısını kesip boş kalan alanı diğer türdeki erimiş agarla doldurarak yarı yarıya petri kapları hazırlayın. Her iki yarının hacminin eşleştiğinden ve belirgin bir kenar oluşmadığından emin olun.

Bu işlem, oda sıcaklığında hazırlanmış yarı yarıya kapla pratik yapmayı gerektirebilir; 30 adet saf, beslenmesi kesilmiş larva yerleştirin. Üçüncü olarak, yıldız larvaları kabın merkezine koyun. Kapağı kapatın ve beş dakika bekleyin.

Ardından, şablonu kullanarak her iki yandaki larva sayısını ve ortadakilerin sayısını belirleyin. Açıklanan prosedür, trenchgenic larvaların eğitilmesi ve test edilmesi için kullanılmıştır. Örnek uyaranlar kullanılarak veriler, Petri kaplarının farklı bölgelerindeki larva sayısı olarak kaydedilmiştir.

Bu veri tercihinden beş dakika sonra indeksler hesaplandı ve karşılıklı olarak eğitilen gruplardan performans indeksleri türetildi. Test edilen larvalar transgenik olduğundan, dolu bir koku konteyneri ile hava arasında bir seçimin yanı sıra, saf kokular ile şeker eklenmiş kokular arasında da bir seçim sunuldu. Hesaplanan indekslerin kutu grafiği (box plot) ile incelenmesi, hayvanların fruktoz kokularını bir iştah pekiştiricisi olarak kullanarak bir oktanolü ML asetattan ayırt etmeyi öğrenebildiklerini ortaya koydu.

Hayvanlar her iki uyaranı da çekici olarak tanımlamış ve aero'ya kıyasla fruktoz aromasına karşı doğal bir tercih göstermiştir. Bu deneysel paradigma, çok çeşitli koku ve görme uyaranlarının yanı sıra çok çeşitli ödüllendirici ve cezalandırıcı uyaranlarla başarıyla kullanılmıştır. Bu paradigmanın, drosophila'da mevcut olan birçok güçlü genetik manipülasyonla birleştirilmesi, nöral ağların analiz edilmesinde özellikle yararlıdır; örneğin, gal four ekspresyon modelleriyle tanımlanan belirli nöron setleri genetik olarak manipüle edilerek, bu nöronların iştah öğrenimindeki fonksiyonel rolleri değerlendirilebilir.

Bu prosedür, nöronal fonksiyonların genetik interferansı ile birlikte, larva beyninde öğrenme ve hafıza ile ilişkili nöral ağların analiz edilmesi için kullanılabilir. Larva beyninin basitliği sayesinde, bu işlem tek hücre düzeyine kadar gerçekleştirilebilir.