İnsan Diş Pulp Kök Hücre İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Karşılaştırmalı Farklılaşma İki Farklı Yöntemler Kullanılarak Daimi Dişler türetilen

Bu prosedürün genel amacı, iki farklı yöntem kullanarak kalıcı dişlerden insan genital pulpa kök hücrelerini izole etmek, karakterize etmek ve farklılaştırmaktır. Bu işlem, sağlıklı gömülü yirmi yaş dişlerinin toplanması ve başlangıçta sement-emaye birleşim yerinden kesilmesiyle gerçekleştirilir. Dental pulpa kök hücreleri (D PSCs) iki farklı yöntemle izole edilir.

İlk yöntemde, polip dokuları kollajenaz tip 1 ve disk boşluğu solüsyonu içerisinde inkübe edilerek enzimatik olarak sindirilir. Burada bunları ed olarak adlandırıyoruz. İkinci yöntemde kullanılan izolasyon yöntemi göz önüne alındığında, palp dokuları herhangi bir sindirim işlemi uygulanmadan doğrudan flask içerisine yerleştirilir.

Bu şekilde, dpss dokudan flaska göç etmeye başlar. OG olarak adlandırılan bu hücreler, outgrowth (dışa büyüme) izolasyon yöntemine atıfta bulunur. Prosedürün ikinci adımı, akış sitometrisi kullanılarak kök hücrelerin tanımlanmasıdır.

Prosedürün üçüncü adımı odontoblast farklılaşmasının indüksiyonudur ve prosedürün son adımı, iki grup arasındaki odontoblast farklılaşmasının Alizarin Red boyama ve qPCR ile karşılaştırmalı değerlendirmesidir. Ben Rian Enstitüsü Kök Hücre ve Gelişim Biyolojisi Bölümü'nden RA Kde. Bugün size iki yöntem kullanarak insan mezenkimal kök hücrelerinin izolasyonunu, karakterizasyonunu ve karşılaştırmalı farklılaşmasını göstereceğim.

Merhaba, ben Rio Enstitüsü'nden Dr. Rezaian. İnsan dental pulpa kök hücreleri ile ilgili bir proje üzerinde çalışıyoruz. Bu hücreler, minimum ağrı ve morbidite ile elde edilmesi kolay olan bir tür mezenkimal kök hücredir.

Meşki kök hücreler, plastik yapışma yeteneği, koloni oluşturma ve çoklu farklılaşma kapasitesi ile tanımlanır. Merhaba, ben Kök Hücre Bölümü'nden Dr. Ami. Enstitüde, araştırma çalışmaları ve gelecekteki uygulamalar amacıyla kök hücreleri izole etmek için laboratuvarımızda bu prosedürü kullanıyoruz.

Rejeneratif tıpta, bu kök hücre kaynağının gelecekteki kök hücre tabanlı tedavilerde kullanılabilmesi için atılacak ilk adım, insan dokusundan kök hücreleri izole etmek için en uygun protokolün seçilmesidir. Bu hedefe ulaşmak için, farklı kök hücre izolasyon koşulları altında hücresel davranışın belirli yönlerini incelemek büyük önem taşımaktadır. İlk olarak, pulpanın enzimatik disosyasyonunu veya doku implantlarından kök hücrelerin dışa büyümesini (outgrowth) kullanarak insan dental pulpa kök hücrelerini izole edeceğim.

Ardından bunları karakterize edin ve ogen blastlarına farklılaştırın. Öyleyse başlayalım. İlk olarak, PBS içerisinde çözünmüş olan space ve tip 1 kollajenazı hazırlayın.

Ardından bunları 0,2 micron şırınga filtresi kullanarak filtreleyin. Her ikisini de konik tüpe çekin. Daha sonra, final konsantrasyonuna ulaşmak için pener ve PBS ekleyin.

Sağlıklı gömülü dişleri, steril koşullar altında soğuk bazal ortamda laboratuvara aktarın. Çalışmaya başlamadan önce diş yüzeyini %70 ethanol ile temizleyin. Diş yüzeyindeki kalıntıların tamamen temizlendiğinden emin olun.

Pulpa odasını açığa çıkarmak için sterilize edilmiş diş diski kullanarak dişi sement-emaye birleşim yeri boyunca kesin. Diş dokusunun aşırı ısınmasını önlemek için kesme işleminin yavaşça gerçekleştirilmesi gerektiği göz önünde bulundurulmalıdır. Ardından, Scarpa bıçağı ile pulpa dokusunu kurondan nazikçe ayırarak pulpa dokusunu bir ila iki milimetrelik parçalara bölün.

Pulpa dokusunun küçük parçalarını, pulpa dokularının parçalanmasına yardımcı olmak için her 30 dakikada bir vorteksleyerek, 37 °C'de bir saat boyunca bir mililitre enzim çözeltisine aktarın. Ardından, parçaları 70 µm hücre süzgecinden geçirerek büyük agregatları uzaklaştırın. Daha sonra PENER içeren PBS ekleyip 1.200 RPM'de beş dakika santrifüj edin.

Süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın. Ardından plakayı proliferasyon ortamında süspande edin, kültür flaskına aktarın ve ortam ekleyin. Sonrasında inkübe edin.

Dış çalışma yöntemi için hücre konfluansı sağlanana kadar her üç günde bir medyumu değiştirin. Kesme işlemini tekrarlayın. Diş kesimi, dokuların bir ila iki milimetrelik fragmanlara ayrılması anlamına gelir.

Ardından bunları kültüre yerleştirin. Proliferasyon besiyeri ile doldurun ve inkübe edin. Proliferasyon besiyerinin toplam hacminin, hücrelerin daha fazla büyümesi için tüm parçaların yapışmasına destek olacak şekilde ayarlanması gerektiği göz önünde bulundurulmalıdır.

Çimlenme gözlemlendikten sonra ve ardından hücre konfluensine ulaşılana kadar her üç günde bir besiyerini değiştirin. İmmünofenotipleme için, her iki D PSC türünü de PE veya FITC konjuge antikorlarla 4 °C'de, karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe edin. Ardından PBS ekleyin ve 1.200 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Süpernatantı uzaklaştırın ve plakayı PBS içinde yeniden süspanse edin; son olarak, her iki DPC tipini üç pasaj boyunca subkültür yaparak akış sitometresi ile yüzey belirteçlerini değerlendirin. Ardından tripsinizasyon yapın ve hücreleri %60 konfluensle altı kırmızı kültür kabına aktarın; PM'yi odontojenik ortam ile değiştirin. Üç kuyuya PM eklenerek negatif kontrol olarak tutulur.

Besiyerini her üç günde bir değiştirin ve 21. günde hücreleri PBS ile yıkayın. Ardından, kuyucuk başına bir mililitre %10 formalgel ile oda sıcaklığında 15 dakika boyunca sabitleyin.

15 dakika sonra fiksatif dikkatlice uzaklaştırılır ve hücreler distile su ile üç kez yıkanır. Ardından su, her bir hücre grubu için bir mililitre kırmızı boyama çözeltisi ile değiştirilir. 20 dakika sonra fazla boya uzaklaştırılır ve hücreler deiyonize su ile dört kez yıkanır.

Ardından, hücrelerin kurumasını önlemek için kuyuk başına bir mililitre su ekleyin. Boyama işleminden sonra, mikroskop altında kontrollerle karşılaştırıldığında üç üst rayın kırmızıya döndüğünü görebilirsiniz; kırmızı boyamanın kantifikasyonu için yüksek büyütme ile hücre çevresindeki boya rengi absorpsiyonunu görebilirsiniz. Suyu uzaklaştırdıktan sonra, kuyuk başına bir mililitre %10 asetik asit ekleyin ve ardından sallayarak 30 dakika boyunca inkübe edin.

Ardından, bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri plakadan nazikçe kazıyın. Daha sonra hücreleri ayrı tüplere aktarın. VOR 30 saniye boyunca güçlü bir şekilde uygulanır.

Ardından bunları 85 °C'de 10 dakika boyunca ısıtın. Buharlaşmayı önlemek için tüpleri ParaFilm ile kapatın ve beş dakika boyunca buz üzerinde bekletin, ardından 20,000 ×g'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Bu sırada, bölge protokolüne uygun olarak Alzheimer red standart seri dilüasyonunu hazırlayın.

Santrifüj işleminden sonra, süpernatantı uzaklaştırın ve yeni tüplere aktarın. pH değerini %10 amonyum hidroksit ile nötralize edin. Ardından, standartları ve örnekleri 96'lık plakaya ekleyin.

Ardından kuyucuk plakasında 405 nanometrede absorbansı ölçün ve verileri standart seri dilüsyona göre analiz edin. Burada, 10., 15. ve 18. günlerde enzimatik ayrıştırma ile izole edilen DPSC'leri ve ayrıca 5., 10., 13. ve 18. günlerdeki outgrown DPC'leri görebilirsiniz. Üçüncü aşamadaki her iki DPSC tipi de neredeyse aynı boyut ve morfolojidedir. İmmünofenotipleme sonuçları, CD 44, CD 73 ve CD 19 gibi mezenkimal kök hücre belirteçlerinin varlığını; CD 34, CD 45 ve CD 11 B gibi hematopoetik ve endotelyal belirteçlerin ise yokluğunu göstermektedir. İlginç bir şekilde, CD 105 ve CD 146 ekspresyonları, D-P-S-C-E-D ile karşılaştırıldığında outgrown dPSC'lerde daha fazladır. Odontoblast diferansiyasyonunun 21. günündeki alizarin red boyamasının kantifikasyonu, D-P-S-C-E-D'de dental pulpa kök hücrelerine kıyasla daha fazla kalsiyum birikimi olduğunu göstermektedir.

QPCR sonuçları ayrıca, D-P-S-C-D'de mineralizasyon markerları olan MEP ve ALP'nin, çıkış dental kök hücrelerine kıyasla anlamlı derecede daha yüksek ekspresyonlar gösterdiğini belirtmektedir. Bu arada, her iki gen de diferansiyasyon sırasında regüle edilmekte ve odontojenik marker olan DSPP'nin ekspresyonu da diferansiyasyon süresince artmaktadır. Bununla birlikte, ED ve OG grupları arasındaki diferansiye olmuş hücrelerde DSVP ekspresyonunda anlamlı bir varyasyon yoktur.

Pulpanın enzimatik disosiyasyonunu veya doku eksplantından kök hücrelerin dışa büyümesini kullanarak insan dental papilla kök hücrelerinin nasıl izole edileceğini gösterdik. Hepsi bu kadar. Bu prosedürü deneylerinizde kullanma girişimlerinizde size bol şans dilerim.

Teşekkürler.