Enzimatik bir hücre füzyon deneyi kullanılarak SNARE-aracılı membran füzyon analizi

Bu prosedürün genel amacı, beta galaktosidazın aktive edilmiş ekspresyonu yoluyla snare aracılı hücre füzyon olaylarını nicelendirmektir. Bu işlem, öncelikle v ve t snare proteinlerinin cost seven hücrelerinin yüzeyinde ektopik olarak eksprese edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün bir sonraki adımı, V snare proteinlerini eksprese eden hücrelerin, T snare proteinlerini eksprese eden hücrelerle birleştirilmesidir.

Bu durum snare aracılı hücre füzyonuna ve beta galaktozidasın aktive edilmiş ekspresyonuna yol açar. Nihayetinde, hücre füzyonu ile indüklenen beta galaktozidaz aktivitesi bir spektrofotometre kullanılarak ölçülür. Bu tekniğin veya mikroskobik SAL bölgesi analizi gibi mevcut yöntemlerin temel avantajı, birden fazla snare kombinasyonunu analiz edebilmesidir.

Nicel olarak, bu yöntem snare aracılı membran füzyonunun mekanizmasını ve düzenlemesini anlamak için uygulanabileceği gibi, yüksek kapasiteli çalışmalar yürütmek için de kullanılabilir. Prosedürü, laboratuvarımdan doktora sonrası araştırmacı Doc Na Hassan ve teknisyen David Humphrey uygulamalı olarak gösterecekler. Transfeksiyon yüklemesinden bir gün önce.

12 milimetrelik cam lameller içeren 24 kuyucuklu plakalar kullanın; bu lameller üzerine, deneydeki farklı plazmidleri eksprese eden hücre kombinasyonlarının her biri için ikişer kuyucuk hazırlayın. Transfeksiyon için, 4,5 g/L glukoz ve %10 FBS ile desteklenmiş DMEM'de kültüre edilmiş 30.000 COST7 hücresini ekleyin. V hücrelerinin bulunduğu her bir kuyucuğa 0,25 µg TTA plazmidi ve bir set ekspresyon plazmidi ekleyin.

Bu durumdaki ilgi duyulan ters çevrilmiş proteinleri, yani ters çevrilmiş vamp'leri transfekte etmek için T hücrelerine, TRE lacks Z'yi kodlayan plazmitin çeyrek mikrogramını ve ilgi duyulan ters çevrilmiş proteinleri kodlayan tamamlayıcı plazmit setini ekleyin. Bu durumda bunlar snap 25, syntaxin one ve syntaxin four'dur. Şimdi cost seven hücrelerini üretici talimatlarına göre lipectomy ile transfekte edin ve hücreleri 24 saat boyunca kültüre edin; transfeksiyondan 24 saat sonra hücreleri supplementli paraformaldehitte 10 dakika boyunca sabitleyin. Sabitleme işleminden sonra hücreleri üç kez PBS++ ile durulayın, ardından hücreleri supplementli FBS ile 30 dakika boyunca bloke edin.

Bloklama işleminden sonra, hücreleri anti mic monoklonal antikoru Nine E 10 ile 30 dakika boyunca inkübe edin. PBS++ ile dört yıkama yaptıktan sonra, hücreleri 1:500 dilüsyonundaki fitzy konjuge ikincil antikorlarla bir saat boyunca inkübe edin. PBS++ ile dört yıkama daha yaptıktan sonra, işaretlenmiş hücreleri ticari olarak temin edilebilen anti-fade reaktifi ile kapatın.

Hücreler artık konfokal mikroskopi için hazırdır; transfeksiyondan bir gün önce, analiz edilecek her plazmid kombinasyonu için her bir 100 milimetrelik doku kültürü kabına 1,2 milyon Cos-7 hücresi ve altı kuyucuklu plakaların her kuyucuğuna 200.000 Cos-7 hücresi ekleyin. Bir kuyucuk hazırlayın ve hücreleri 24 saat boyunca kültüre edin. Ertesi gün, transfeksiyon için plazmidleri ekleyin; V hücreleri için, her bir 100 milimetrelik kültüre ilgili GFP proteinini eksprese eden bir plazmid ve 5 µg pTet-Off ekleyin.

100 milimetrelik bir kültür kabındaki kontrol hücrelerini, V hücreleri ile aynı bağıl konsantrasyonlarda boş bir vektör ve P te off ile kotransfekte edin. Tüm plazmidler V hücrelerine ve kontrol hücrelerine eklendikten sonra, vamp'lerin N-glikozilasyonunu önlemek için bu kuyucuklara tcom mycin ekleyin. Altı kuyucuklu plakaların her bir kuyucuğunda, T hücrelerini ilgili proteinleri eksprese eden tamamlayıcı plazmidler içeren bir mikrogram PBIG ile kotransfekte edin.

Şimdi cost seven hücrelerini üretici talimatlarına uygun olarak lip ile transfekte edin. Ardından hücreleri 24 saat boyunca kültüre edin; transfeksiyondan 24 saat sonra V hücrelerini enzim içermeyen hücre ayrıştırma tamponu ile kültür kaplarından ayırın. İşleme hücreleri bir kez 20 milliliters PBS ile yıkayarak başlayın.

Ardından beş mililitre enzim içermeyen disosiasyon tamponu ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakikalık inkübasyonun ardından, plakaya sertçe vurularak hücrelerin yerinden ayrılması sağlanır; hücrelerin ayrılıp ayrılmadığı mikroskop altında kontrol edilir. Hücrelerin yarısından azı ayrılmışsa, beş dakika daha bekleyin ve plakaya tekrar vurun.

Hücrelerin yarısından fazlası ayrılana kadar hücreleri ayırma tamponunda inkübe etmeye devam edin. Ardından, V hücrelerini bir hemositometre ile sayın. Sonrasında, V hücrelerini takviye edilmiş DMEM Hanks dengeli tuz çözeltisi tamponunda mililitre başına yaklaşık 480,000 hücre konsantrasyonunda yeniden süspande edin.

Şimdi, T hücrelerini içeren her bir kuyucuğa bir mililitre resüspande edilmiş V hücresi ekleyin ve plakaları inkübatöre geri yerleştirin. Hücreleri altı, 12 veya 24 saat boyunca birlikte kültürledikten sonra, onları PBS ile yıkayın ve lizis tamponu ekleyin. Ardından, hücreleri kuyucuklardan sıyırarak santrifüj için tüplere aktarın.

Santrifüj işleminden sonra, süpernatantı yeni bir tüpe aktarın ve ticari olarak mevcut bir assay kullanarak, üreticinin talimatlarına uygun şekilde beta galakto ekspresyonunu ölçün; bu protokol sırasında, sonuçları puanlamak için bir molar sodyum karbonat ekleyerek kolera metrik reaksiyonu 90 dakika sonra durdurduğunuzdan emin olun. Absorbansı bir spektrofotometre ile 420 nanometrede ölçün. CO seven hücreleri flipped snare plazmidleri ile transfekte edildiğinde, flipped snare proteinleri hücre yüzeyinde eksprese edildi.

Hücre yüzeyindeki snare proteinlerinin ekspresyon seviyelerini ölçmek için akış sitometrisi kullanılmıştır. Membran füzyon kapasitelerini karşılaştırabilmek için vamp'lerin aynı seviyede eksprese edilmesi gerekiyordu. Bu nedenle, transfeksiyonda kullanılan her bir ters çevrilmiş snare plazmidinin konsantrasyonu titre edilmiş ve transfeksiyon için optimize edilmiştir.

Bu koşullar altında, vamps 1, 3, 4, 5, 7 ve sekiz ile syntaxin bir ve dört hücre yüzeyinde sırasıyla aynı düzeyde eksprese edilmiş olup, sinaptik eksositozu yöneten nöronal snare proteinleri assay'in uygulanabilirliğini test etmek için kullanılmıştır. Nitekim, vamp iki eksprese eden V hücreleri ile SYNTAXIN bir snap 25 eksprese eden T hücreleri birleştirildiğinde, güçlü beta galaktosidaz ekspresyonu tespit edilmiştir. Bununla birlikte, vamp iki veya SNAP 25'ten herhangi biri eksprese edilmediğinde, yalnızca bazal beta galaktosidaz aktivitesi tespit edilmiş olup, bu durum hücre füzyonunun ve beta galaktosidaz ekspresyonunun v ve t snare proteinlerinin etkileşimlerine dayandığını göstermiştir; genel olarak SYNTAXIN bir, snap 25, vamp bir, vamp üç ve vamp sekiz karşılaştırılabilir düzeyde ve en yüksek füzyon aktivitelerine sahipti.

Buna karşılık, bazal beta GAL aktivitesi, protein kombinasyonunun vamp five ve SYNTAXIN one arasındaki durumun aksine membran füzyonunu tetiklemediğini göstermektedir. Snap 25. Enzimatik füzyon testi gerçekleştirilirken, SNARE proteinlerinin N-glikozilasyonunu önlemek için tunicamycin eklemeyi ve SNARE proteinleri arasında disülfit bağ oluşumunu önlemek için DTT eklemeyi hatırlamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, hücre füzyon analizinin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.