E4orf4 Bağlı Hücre Ölümü üzerine Nakavt Etkilerinin Gen Ekspresyonu ve Ölçüm Şartlı Nakavt için Hücre hatları hazırlanması

Aşağıdaki deneyin genel amacı, ACF1 veya SNF2H nakavtunun E4 veya f4 ile indüklenen hücre ölümü üzerindeki etkisini gözlemlemektir. Bu, ACF1 veya SNF2H srna ekspresyonunun doksisiklin eklenmesiyle koşullu olarak aktive edildiği ve ikinci bir adım olarak ACF1 veya SNF2H protein seviyelerinin azalmasıyla sonuçlanan hücre hatlarının oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. Elde edilen hücre hatlarındaki hücreler, ACF1 veya SNF2H ekspresyonunu azaltmak için doksisiklin ile muamele edilir veya tedavi edilmeden bırakılır.

Ardından, E4orf4; shRNA dirençli ACF1 veya SNF2H olan veya olmayan hücrelerde eksprese edilir. ACF1 veya SNF2H'nin E4orf4 tarafından indüklenen hücre ölümü üzerindeki etkisini araştırmak amacıyla, JY analizi kullanılarak apoptotik morfolojiye sahip çekirdeklerin sayılmasına dayalı olarak ACF1 veya SNF2H seviyelerinin E4orf4 toksisitesi üzerindeki etkisini gösteren sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin RNA'ların geçici transfeksiyonu gibi diğer yöntemlere karşı temel avantajı, tüm hücrelerin shRNA eksprese etmesi ve geleneksel plazmid ile birlikte ko-ekspresyon gerçekleştiren hücre yüzdesinin daha yüksek olmasıdır. Bu yöntem, E4orf4 tarafından indüklenen hücre ölümünün altında yatan mekanizmalara dair içgörü sağlar, ancak diğer protik proteinlerin çalışılmasına da uygulanabilir.

Ana Lafe'ye ek olarak, laboratuvarımdan bir araştırmacı bu prosedürün bölümlerini uygulamalı olarak gösterecektir. İndüklenebilir hücre hatları oluşturma prosedürüne başlamak için, T-Rex 2 9 3 hücrelerini, tetrasiklin içermeyen ancak serum ve 5 µg/mL blasticidin içeren 8 mL DMEM içinde, 10 cm'lik plak başına yaklaşık 5 × 10⁶ hücre yoğunluğunda ekleyin. Plakaları 37 °C ve %5 CO₂ ortamında gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, transfeksiyondan önce medyumu 8 mL taze medyum ile değiştirin. Transfeksiyon için kullanılan plazmit; tetrasiklinle indüklenebilir H1 promotörü tarafından yönlendirilen ve ACF1 veya SNF2H shRNA kodlayan, ayrıca konstitütif bir PGK promotörü tarafından yönlendirilen ve GFP ile birleştirilmiş neomisin direnç genini içeren PsupNeo+GFP plazmididir.

10 µg plazmit DNA'yı 500 µL 150 mM sodyum klorüre ekleyin ve vorteksleyin. Ardından, DNA'nın mikrogram başına iki µL olacak şekilde jet PY reaktifini, 500 µL 150 mM sodyum klorür içeren başka bir tüpe ekleyin ve vorteksleyin. Jet pie çözeltisini DNA'ya ekleyin ve vorteksleyerek iyice karıştırın.

Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. 15 dakika sonra, DNA komplekslerini %70 ila %80 konfluense sahip 10 santimetrelik plakalara dikkatlice pipetleyin. T-Rex 2 9 3 hücreleri ertesi gün karışım halindedir.

Besiyerini, bu örnekte daha önce olduğu gibi mililitre başına 500 µg G418 içeren selektif bir besiyeri olan DMEM ile değiştirin. Sonraki iki hafta boyunca hücreleri izleyin. Koloniler oluşana kadar selektif besiyerini her üç ila dört günde bir benzer taze bir besiyeri ile değiştirin.

Kolonileri gözle belirleyin ve konumlarını renkli bir kalem kullanarak plağın altına işaretleyin. Kolonilerin birbirlerinden yeterince ayrıldığını mikroskop altında doğrulayın. Koloniler, mikroskop olmadan görülebilecek kadar büyüdüklerinde izole edilebilirler.

Bu prosedürün başarısı için, koloni izolasyonu sırasında birbirinden iyice ayrılmış kolonilerin seçilmesi önemlidir. Steril bir kabinde, plakadaki besiyerini aspire edin. PBS ile nazikçe durulayın ve kalan tüm sıvıyı iyice aspire edin.

Plakadaki bir koloniye, hücreler plakadan ayrılana kadar tekrarlayan pipetleme hareketleri uygulayarak 3 µL %0,25 tripsin/EDTA ekleyin. Hücreleri 24 kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğundaki seçici besiyerine aktarın. İşlemi plaka üzerindeki diğer birkaç koloni için tekrarlayın.

Hücreleri, kuyucuğu doldurana kadar 37 °C'de, %5 karbondioksit altında büyütün. Ardından, her bir orijinal koloniden alınan hücreleri, ayrı bir 12 kuyucuklu plakadaki üç farklı kuyucuğa paylaştırın ve ertesi gün gece boyunca inkübe edin. Bir plaktaki besiyerini, çift distile su ile hazırlanmış bir stok çözeltiden gelen mililitrede bir mikrogram doksisiklin içeren besiyeri ile değiştirin.

Kontrol plağındaki besiyerini, doksisiklin içermeyen besiyeri ile değiştirin. Hücreleri 37 °C'de, %5 karbondioksit ile 72 saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, ACF1 veya SNF2H nakavt verimliliğini belirlemek için western blot analizi amacıyla, bir işlem görmüş ve bir işlem görmemiş kuyucuktan hücreler hasat edilir; temsilci bir sonuç burada gösterilmiştir.

Bu blot, SNF2H ve alfa tubulin antikorları ile boyanmıştır. İkincisi, klonların yükleme kontrolü olarak hizmet etmektedir. Dört ve beş numaralı klonlar, doksisiklin indüksiyonu üzerine SNF2H miktarında güçlü bir azalma göstermiştir ve bu nedenle, bir sonraki bölümde gösterilecek olan knockdown deneyinde kullanılmak üzere seçilmişlerdir.

Üçüncü plaktaki işlem görmemiş hücreler, seçilen hücre hattını genişletmek için kullanılacak ve daha sonra bu hücrelerin alikotları dondurulacaktır. Seçici ortamdaki 10 santimetrelik plakalarda ACF bir veya SNF iki H hücrelerinin knockdown etkisini indüklemek amacıyla, plakaların yarısına mililitre başına bir mikrogram doksisiklin ekleyin ve 37 degrees Celsius, %5 carbon dioxide ortamında 48 ila 72 saat inkübe edin. Her plaka grubu, her nokta için iki tekrarlı DPI testi ve her örnek için bir western blot analizi plakası dahil olmak üzere, 12 adet altı santimetrelik plaka için gerekli hücreleri sağlamalıdır.

İndüksiyondan 48 ila 72 saat sonra, her hücre grubundaki hücreleri tripsin ile ayırın ve saydıktan sonra 6 cm'lik plak başına 1,5 x 10⁶ hücreyi, doksisiklin içeren veya içermeyen aynı ortamda ekleyin. Hücreleri 37 °C'de, %5 karbondioksit altında gece boyunca inkübe edin; ertesi gün hücreleri belirtildiği şekilde transfekte edin.

Hem işlem görmemiş hem de doksisiklin ile işlem görmüş hücreler, dört farklı yöntemle üçer paralel şeklinde transfekte edilir. Birincisinde boş bir plazmid ve GFP eksprese eden bir plazmid; ikincisinde boş plazmidin yanı sıra SHRA dirençli ACF1 GFP veya SNF2 HGFP eksprese eden bir vektör; üçüncüsünde E4 kodlayan bir plazmid veya hem E4 hem de GFP eksprese eden bir plazmid ve dördüncüsünde E4 kodlayan plazmid ile SHRA dirençli ACF1 GFP veya SNF2 HGFP eksprese eden vektör kullanılır. Transfeksiyonun ardından tüm plaklar 37 °C'de ve %5 karbondioksit içeren ortamda gece boyunca inkübe edilir.

Hücrelerin transfeksiyonundan sonraki gün, ACF1 veya SNF2H'nin etkin bir şekilde susturulduğunu ve E4 veya E4'ün farklı örneklerde eşit şekilde eksprese edildiğini belirlemek amacıyla, her örnek için bir plakadan Western blot analizi için proteinleri ekstre edin. Geriye kalan 16 plak DPI analizi için kullanılacaktır. DPI analizi için ayrılan plakalardaki besiyerini aspire edin ve hücreleri kimyasal çeker ocak altında PBS ile nazikçe yıkayın.

Hücrelerin üzerini kapatacak şekilde, PBS içinde hazırlanmış %4'lük paraformaldehitten bir mililitre ekleyin ve oda sıcaklığında, çalkalamadan 15 dakika boyunca inkübe edin. Paraformaldehidi aspire edin ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca çalkalayarak PBS ile yıkayın. Toplam üç yıkama olacak şekilde yıkama işlemini iki kez daha tekrarlayın; üçüncü PBS yıkamasından sonra, -20 °C'de saklanan %80'lik Ethanol ile yıkayın ve -20 °C'de en az bir saat boyunca inkübe edin.

Etanolü aspire edin ve hücreleri oda sıcaklığında, her seferinde beş dakika boyunca çalkalayarak iki kez PBS ile yıkayın; ardından oda sıcaklığında, spesifik olmayan antikor bağlanmasını önlemek için yine çalkalayarak, %0,5 BSA ve %0,05 Tween 20 içeren PBS veya PBS-T ile beş dakika boyunca bir kez daha yıkayın. Hücreleri, oda sıcaklığında çalkalayarak %10 keçi serumu içeren bir mililitre PBS-T tamponu ile 20 dakika boyunca bloklayın.

Ardından hücreleri, her bir yıkama beş dakika sürecek şekilde, P-B-S-B-T ile iki kez yıkayın. Hücreleri, bu durumda E4 veya 4'e özgü bir primer antikor ile, bir mililitre P-B-S-B-T içerisinde, oda sıcaklığında çalkalayarak bir saat boyunca inkübe edin. Daha sonra hücreleri iki kez P-B-S-B-T ile ve bir kez %0,1 BSA içeren PBS ile, her bir yıkama beş dakika sürecek şekilde yıkayın.

Ardından, hücrelere uygun ikincil floresan işaretli antikor ve 0,5 µg/mL final konsantrasyonunda DPI içeren bir mililitre PBS %0,1 BSA ekleyin; oda sıcaklığında, karanlıkta ve çalkalayarak 40 dakika inkübe edin. Son olarak, beş dakika boyunca PBS ile yıkayın.

Kuyu aspirasyonla kurutun ve tam kuruma sağlamak için plakaları ters çevrilmiş halde bir saatten bir geceye kadar bekletin ve alüminyum folyo ile örtün; flora Mount G çözeltisi kullanarak hücrelerin üzerine lamlar monte edin. Sayıma hazır olana kadar plakaları dört derece santigrat sıcaklıkta, karanlıkta saklayın. Protokolde açıklanan çeşitli işlemlere tabi tutulan apoptotik çekirdekli hücreler, transfekte edilmiş hücrelerin çekirdeklerini görüntülemek amacıyla E4 veya dört spesifik antikor ve DPI ile fikse edilip boyanmıştır.

Bu şekil, E four or four ve GFP eksprese eden hücrelere bir örnek göstermektedir; panel A yalnızca kontrol GFP protein ekspresyonunu, panel B ise E four or four ekspresyonunu göstermektedir. Panel C'de DAPI ile boyanmış çekirdekler, panel D'de ise birleştirilmiş görüntüler verilmiştir. Beyaz oklar, apoptotik morfolojiye sahip çekirdekler içeren GFP ve E.Four or four transfekte hücrelerini işaretlemektedir. Kırmızı oklar, apoptotik çekirdek olarak sayılmayan düzensiz şekilli çekirdekleri işaret etmektedir; yıldızlar ise mitotik çekirdekleri veya yeni bölünmüş çekirdekleri belirtmektedir. Testin optimal objektifliğini korumak amacıyla, transfekte hücre popülasyonu içindeki apoptotik morfolojiye sahip çekirdeklerin yüzdesini hesaplamak için DAPI boyaması ile görselleştirilen yoğunlaşmış veya fragmente olmuş çekirdeklerin sayısı belirlenmiştir.

Çeşitli örneklerdeki apoptotik çekirdeklerin sayımı, sayımı yapan kişinin örnek kimliğinden haberdar olmadığı kör bir yöntemle gerçekleştirilmiştir. Temsili bir sonuç bu grafikte gösterilmiştir. E four or four eksprese eden hücrelerde daha yüksek oranlarda nükleer anomaliler gözlemlenmiş ve bu durum T four or four'un hücre ölümünü indüklediğini doğrulamıştır. Nükleer anomalilerin en yüksek yüzdesi, ACF1 seviyelerinin shRNA aracılı knockdown ile düşürüldüğü E four or four eksprese eden hücrelerde gözlemlenmiştir; bu durum ACF1 knockdown'ın E four or four tarafından indüklenen hücre ölümünü artırdığını ve hücrelerde E four or four toksisitesini artırdığını göstermektedir.

Western blot'ta görüldüğü üzere, düşük ACF seviyelerinin ekspresyonu E dört veya dört seviyelerinde bir artışla sonuçlanmamıştır. Bu prosedürü gerçekleştirirken, DPI ile apoptotik nükle stentlerin sayımını kolaylaştırmak ve bu nüklelerin tanımlanması için katı kriterler uygulamak önemlidir. Bu prosedüre ek olarak, prosedürün ardından DA pse sonuçlarını doğrulamak için klonojenik assay'ler gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Ek soruları yanıtlamak amacıyla ko-immünopresipitasyon analizleri gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Örneğin, incelenen proteinler arasında fiziksel bir etkileşim olup olmadığı bu şekilde belirlenebilir.