Antijen Özgül Düzenleme için Trans-vivo Gecikmeli Tip Aşırı Duyarlılık Testi

Bu prosedürün genel amacı, insan deneklerde hem proenflamatuar hem de antienflamatuar antijene özgü yanıtları izlemek için trans vivo DTH analizini kullanmaktır. İlk olarak, insan deneğin periferik kanından periferik kan mononükleer hücrelerini izole edin. Ardından, PBMC preparatını PBS ile karıştırın.

Hatırlama antijen testi antijenini ve test antijeni ile hatırlama antijeni karışımını hazırlayın. Ayak tabanı ön ölçümlerine geçin ve hazırlanan karışımları skid farelerine enjekte edin. Ayak tabanı ölçümlerini 24 saat sonra tekrarlayın. Üç.

DTH yanıtlarının belirleyici örüntüleri regülatör, regülatör olmayan ve sensitize şeklinde olabilir. Trans vivo gecikmiş tip aşırı duyarlılık testi, antijen kaynağının transplant donör hücreleri olduğu allo reaksiyon yanıtları gibi klinik parametreleri belirlemek için uygulanabilir. Bu tekniğin mevcut in vitro yöntemlere göre temel avantajı, tek bir analiz sistemi kullanarak allo antijenlere, oto antijenlere veya tümör antijenlerine karşı hem pro-inflamatuar hem de regülatör yanıtların kolayca tespit edilebilmesidir.

Laboratuvarımdaki araştırmacılardan Egon, trombosit aktivasyonunu önlemek için asit sitrat dekstroz tüplerine toplanmış taze insan periferik kanı kullanarak prosedürü gösterecektir. Standart yöntemlere uygun olarak lenfosit ayırma ortamı kullanarak PBMC'leri izole edin. Kontamine trombositleri uzaklaştırmak için PBMC preparatını PBS ile yıkayın.

Belirgin bir eritrosit kontaminasyonu varsa, bir CK lizis tamponu kullanarak kırmızı kan hücrelerinin lizisini gerçekleştirin. Ardından PBS Resus ile iki yıkama daha yapın. Allo antijen için PBMC'leri, mililitrede 10 milyon PBMC konsantrasyonunda PBS içerisinde süspande edin.

Daha önce gösterilen prosedür kullanılarak donör periferik kanından izole edilen P BMC'ler ile başlayın. Ardından resus. Donör hücreleri, mililitre başına 120 milyon hücre konsantrasyonunda PBS içinde süspande edin ve protein degradasyonunu önlemek için bir mikromolar PMSF ekleyin.

Şimdi hücre süspansiyonunu, iki milimetrelik bir prob sonikatör kullanarak, birer saniyelik yedi puls ile sonikasyon işlemine tabi tutun. Bir hemositometre kullanarak hücrelerin %90'ından fazlasının parçalandığını doğrulayın.

Ardından, karışımı 4 °C'de 20 dakika boyunca 14.000 RPM'de santrifüjleyin. Süpernatantı dikkatlice iki adet safe-lock tüpe aktarın ve her enjeksiyon için standart yöntemlerle protein konsantrasyonunu belirleyin. 10⁶ PBMC'den yedi adet alikotu iki mililitreye bölün.

Güvenli kilitli tüplerdeki hücreler santrifüjleme ile çöktürülür. İlk olarak, 35 µL PBS içerisinde PBMC'lerin negatif kontrol süspansiyonunu hazırlayın. Ardından pozitif kontrol için 25 µL anımsatıcı antijen (tetanos toksoidi, difteri toksoidi) ekleyin ve enjeksiyon hacmini PBS ile 35 µL'ye tamamlayın.

Donöre özgü yanıtın değerlendirilmesine yönelik deneysel tasarıma göre, hücre peletini 10 µL donör antijeni ve 25 µL PBS ekleyerek toplam 35 µL hacimde yeniden süspande edin. Deneysel donör antijeni özgü regülasyonun değerlendirilmesi için, hücre peletini 10 µL donör antijeni ve 25 µL hatırlatma TT DT antijeni ekleyerek 35 µL hacimde yeniden süspande edin. İsofluran ile anestezi uygulandıktan sonra, ölçüm bölgesinin tutarlılığını sağlamak için bir referans noktası oluşturacak şekilde, yaylı kumpasın bir kenarı ayağın son yürüme pedine değecek şekilde fare ayağının merkezine yerleştirin ve gösterge okuması stabilize olana kadar bekleyin.

Ayak tabanı enjeksiyonu için bazal ayak tabanı kalınlığını kaydedin. Şırıngayı, iğne parmaklara bakacak ve eğimli uç yukarı gelecek şekilde yerleştirin. Şimdi, farelerin arka ayak tabanlarına her bir hücre süspansiyonunun deri altına enjeksiyonlarına başlayın.

Birincisi, sağ ayak tabanına negatif kontrol preparatını yavaşça enjekte edin. Ardından, sol ayak tabanına PBMC artı TT dt pozitif kontrolünü enjekte edin. Şimdi fareyi kafesine geri koyun.

İkinci olarak, sağ ayak tabanına PBMC artı allo antijen, sol ayak tabanına ise PBMC artı allo antijen artı TT dt enjekte edin. Enjeksiyondan 18 ila 24 saat sonra sızıntı olmadığından emin olun. Her fareyi izoflorin ile anestezi edin ve ayak tabanı şişkinliği ölçümünü tekrarlayın.

Ayak pedi şişme değerini elde etmek için, her bir ayak pedinin enjeksiyon öncesindeki kalınlığını enjeksiyon sonrası değerden çıkarın. Ardından, kontrol ayak pedi şişme değerini tedavi gruplarından elde edilen ayak pedi şişme değerlerinden çıkararak antijene özgü net şişmeyi hesaplayın. Pozitif kontrol okumasının, hatırlatıcı antijen TT DT için 25 x 10⁻⁴ inç veya daha fazla bir pozitif kontrol yanıtı verdiğini doğrulayın.

Testin geçerli sayılabilmesi için PBS'ye karşı arka plan yanıtı gereklidir. Ardından, donör antijenlerin varlığında hatırlama yanıtlarının inhibisyonunu belirleyin. Bu deney, renal transplant alıcılarını donör antijene özgü yanıt ve regülasyon açısından değerlendirir.

Transplant alıcılarında gecikmiş tip aşırı duyarlılığın üç ana paterni vardır: regülatör, non-regülatör ve sensitize. Tüm hastalar, hatırlatma antijeni tt pozitif kontrolüne güçlü yanıt vermiştir. 62 numaralı hasta, donör antijenine karşı zayıf bir yanıt ve donör antijeninin varlığında hatırlatma antijeni yanıtına karşı belirgin bir bağlantılı baskılama ile karakterize olan regülatör paterni göstermektedir.

Bu, organ allograft toleransı ile ilişkili olduğu bulunan kalıptır. 48 numaralı hasta, donöre karşı zayıf bir yanıt verme özelliğine sahip olan ancak ilişkili bir baskılanma göstermeyen non-regülatuar bir kalıp sergilemektedir. Bu kalıp, immünsupresif ilaçlar kullanan hastalarda sıklıkla gözlemlenmiştir.

Sekiz numaralı hasta, donör antijenine yüksek yanıt ve bağlantılı bir baskılanma olmamasıyla karakterize donör sensitize paternini sergilemektedir. Bu yanıt, greft reddi ile ilişkilidir. Klinik vaka çalışmalarında, gözlemsel bir çalışmaya dahil edilen deneklerden alınan P BMC'ler; klinik toleranstaki donöre özgü düzenlemenin rolünü değerlendirmek amacıyla donöre özgü indirekt yolak, T efektör ve T düzenleyici yanıtlar açısından analiz edilmiştir.

Donör antijenlerine karşı gelişen indirekt t tector yanıtları, kayıt grupları arasında belirgin bir spektrum ortaya koymaktadır. Hastanın klinik durumu toleran olanlardan kronik reddedilme yaşayanlara doğru ilerledikçe ayak pedi şişliği artmaktadır. Burada, bağlantılı supresyon deneyi, T düzenleyici yanıtın anti donör indirekt yolunu ölçmektedir.

Bu veriler, en toleranslı hastalardan başlayarak ara düzeydeki ve en az toleranslı kronik reddedilme yaşayan hastalara kadar olan aralıkta düzenleyici yanıtların azaldığını göstermektedir. Birlikte değerlendirildiğinde, trans vivo DTH deneyi ile ölçülen bağışıklık düzenlemesinin, renal allogreft kabulü için önemli bir mekanizma olduğu görülmektedir.

Umut verici bir alan, TDTH analizinin otoimmünite izlemedeki uygulamasıdır. Bronşiyolit OBL sendromunun patolojik sürecinde kolajen tip beşin rolü üzerine yaptığımız çalışma, BOS gelişimi için en yüksek göreceli riskin, kolajene pozitif yanıt veren akciğer nakli alıcılarının pbmc'lerinde gözlemlendiğini, ancak sağlıklı kontrollerde veya kolajende gözlemlenmediğini ortaya koymuştur.

Böbrek nakli sonrası dört reaktif good pasture sendromlu hasta sıklıkla kolajen beş reaktifti. TDTH testi, kanser hastalarından alınan pbmc'lerin tümöre özgü antijenlere karşı reaktivitesini test etmek için de kullanılabilir. Örneğin, prostat kanseri hastalarında PAP'a özgü T düzenleyici hücrelerin varlığı, PAP antijeni ile yapılan aşılamaya verilen yanıtı sınırlayabilir.

TRANSVAAL DTH analizi; transplant, kanser ve otoimmün hastalarında hücre aracılı immün yanıtların değerlendirilmesinde klinik uygulaması olan yeni bir tanısal testtir. Sadece efektör T hücre hatırlama yanıtlarının izlenmesinde faydalı olmasıyla değil, aynı zamanda efektör veya regülatör T hücrelerini tespit etmek için belirli bir sitokin ölçümüne dayanmadığı için T regülatör yanıtlarını saptamak amacıyla da kullanılabilmesi nedeniyle değerlidir. Oldukça esnek ve geniş uygulama alanına sahiptir.