Floresans Desenler incelenmesi için Maya Toplulukları Cryosectioning

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bir topluluk içindeki farklı floresan hücre popülasyonlarının mekansal dağılımını incelemek için maya topluluklarının kesitlerini üretmektir. Bu, önce topluluğun dondurulması ve ardından topluluktaki hücrelerin mekansal dağılımını korumak için metanol kullanılarak sabitlenmesiyle elde edilir. İkinci adım olarak, gömme OCT bileşiğinin nüfuz etmesine izin vermek için metanol buharlaştırılır.

Gömülü topluluk daha sonra kriyoseksiyona hazırlık olarak dondurulur. Ardından, bir kriyo bazı bölümler. Topluluk ve kesitler bir floresan mikroskobu altında görüntülenebilir Bir topluluk içindeki floresan hücre popülasyonlarının uzamsal dağılımını gösteren sonuçlar elde edilir.

Bu tekniğin optik kesit alma gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, bu toplulukların derinliklerindeki popülasyonların mekansal dağılımını ortaya çıkarmasıdır. Bu prosedüre başlamak için, bir membran filtrede maya toplulukları büyütün. Bu protokol, eksi 20 santigrat derece dondurucuda altı milimetre çapında bir membran filtredeki sekiz hücrenin iki katından daha az 10'dan daha az tipik bir topluluğa karşılık gelir.

Daha fazla floresan derecesini korumak için, bir santimetre çapın altını kaplamak için bir parça watman 5 4 1 filtre kağıdı kullanın. Peki, bu filtre kağıdı topluluğu aktarmak için bir taşıyıcı olarak kullanılır Daha sonraki aşamalarda, kuyuya bir mililitre eksi 20 santigrat derece, %100 metanol ekleyin ve sıcaklığın dengelenmesi için kuyuyu eksi 20 santigrat derecede bırakın. Şimdi, membran filtreyi toplulukla birlikte en az 15 saniye boyunca sıvı nitrojene batırmak için cımbız kullanarak maya topluluğunu dondurun.

Daha sonra, donmuş topluluğu eksi 20 santigrat derece ile kuyuya aktarın. Dondurucudaki metanol, topluluğun yatay tutulmasını sağlar. Metanole batırırken 20 dakika bekleyin, membran filtre metanol içinde parçalanmaya başlayacaktır.

20 dakika sonra, taşıyıcı watman filtre kağıdını kullanarak topluluğu metanol kuyusundan eksi 20 santigrat derecede tutulan soğuk bir Petri kabına aktarın. Aktarım yaparken, topluluğu taşıyıcı Watman filtresinin üstünde tutun. Soğuk Petri kabına koymadan önce başka bir kalın watman kağıdı parçası kullanarak fazladan metanol damlatın.

Bu, metanol buharlaşma süresinin numuneden numuneye tutarlı olmasını sağlayacaktır. Metanolün buharlaşması için dört ila altı saat bekleyin. Buharlaşmanın doğru zamanda sonlandırılması bu işlemin başarısı için çok önemlidir.

Numunenin aşırı kurumasını önlemek için, metanol buharlaşırken buharlaşma sırasında maya topluluğunun durumunu periyodik olarak kontrol edin. Numunenin her iki tarafından en az yaklaşık iki milimetre kenar boşluğu olacak şekilde yeterince büyük dikdörtgen bir kübik alüminyum folyo kap yapın. Numunenin her taraftan OCT ile çevrili olduğundan emin olmak için bu kabın dibine bir damla OCT ekleyin.

Buharlaşma tamamlandığında, numuneyi eksi 20 santigrat derece dondurucudan çıkarın. Filtre kağıdının maya topluluğu tarafından kapsanmayan kısımlarını kesin. Bu adımı hızlı bir şekilde gerçekleştirmek önemlidir.

Numunenin aşırı kurumasını önlemek için. Topluluğu alüminyum folyo kabın alt yüzeyine yerleştirin ve numuneyi hemen OCT ile topluluk yüksekliğinin üç ila dört milimetre üzerine kadar örtün. 10 dakika bekleyin.

Son olarak, donmuş toplulukları eksi 20 santigrat derece veya eksi 80 santigrat derecede dondurmak için OCT gömülü numuneyi kuru buz üzerinde metal bir plaka üzerine yerleştirin. Donmuş toplulukları bölümlere ayırmaya hazırlanırken, kriyo bölüm odasının sıcaklığını eksi 25 santigrat dereceye ayarlayın. Numuneleri, sıcaklığı odanın sıcaklığına ulaşana kadar haznede bırakın.

Ardından folyoyu numuneden çıkarın ve fazla OCT'yi kesin. Bir kriyo yuvasına bir damla OCT uygulayın ve numuneyi kriyo yuvasına monte edin. OCT kalınlığı iki ila üç milimetre olacak şekilde OCT'yi açıkta kalan watman filtre kağıdı ile numunenin yan tarafına eşit şekilde yayın.

Numunenin her tarafında iki ila üç milimetrelik bir OCT marjının sağlanması, bölümlerin bütünlüğünün korunmasına yardımcı olur. Bölümlere ayırmadan önce OCT'nin kriyostat odasının içinde donmasına izin verin. Numuneyi bıçağa göre hizalamak için OCT numune bloğunun kenarlarını kullanın.

Numune bıçağa göre hizalanmamışsa, kesit alma numunenin bir köşesinden veya yanından başlayacaktır. Bıçağın numune bloğunun mükemmel dikey bir yüzünü kesmesini sağlamak için montajı ayarlayın. Maya toplulukları için tipik bölümler yaklaşık 14 mikrometre kalınlığındadır.

Bir bölümü kestikten sonra, bölümü toplamak için oda sıcaklığında tutulan bir mikroskop lamı kullanın. Slaytı yavaşça kesilen bölüme hareket ettirerek, bölüm eriyecek ve mikroskoba aktarılacaktır. 18 bölüme kadar slayt tek bir slayta aktarılabilir.

Slaytları görüntülemeden önce soğuk sıcaklıklarda, tercihen eksi 20 santigrat derecede saklayın. Maksimum floresan sinyali için dört santigrat derecede bir hafta tutulduğunda sinyal kaybı minimumdur. Kesit alındıktan hemen sonra görüntüleme yapılmalıdır.

Aynı koşullar altında yetiştirilen maya topluluklarının dikey kesitlerinin temsili floresan görüntüleri burada gösterilmektedir. Topluluk, floresan proteinlerle etiketlenmiş iki fototropik vizör suşundan oluşur. Kırmızı olarak görselleştirilen M kirazı ve Y-E-G-F-P, dikey kesitlerinde gösterildiği gibi sütunlu desenlere yol açan alan da dahil olmak üzere paylaşılan kaynaklar için yeşil rekabet olarak görselleştirildi.

Tek bir hücreye kadar olan çözünürlükler enine kesitlerde çözülebilir. Bu şekil, alt panelde gösterilen metanol sabitlemesi ile elde edilen ve üst panelde gösterilen metanol sabitlemesi olmadan elde edilen kesitleri karşılaştırır. Floresan sinyali, topluluk bölümlerinde sabitlenmeden korunur, ancak topluluğun bütünlüğü tehlikeye girer.

Sonuç olarak, bazı hücreler bölümün kenarında yüzer ve genel verim sabit topluluklara kıyasla daha düşüktür. Metanol fiksasyonu, topluluk hücrelerini bir arada tutar, ancak topluluk boyundaki azalmada gözlendiği gibi küçülmeye neden olur. Bu şekil, DS RED ve YFP floresan proteinleri ile bağlanmış iki Protopik vizör suşundan oluşan bir maya topluluğunun temsili parlak alan ve floresan dikey kesitlerini göstermektedir.

Topluluğun üstündeki hücreler, parlak alanda daha güçlü saçılma ve daha parlak floresan ile karakterize edilen, ana hücrelerden farklı görünen bir taç oluşturur. Bu modeller, maya kolonilerinde bildirilen farklılaşma modelleriyle tutarlıdır. Bu videoyu izledikten sonra, maya toplulukları içindeki floresan su mekansal modellerini incelemek için kriyoseksiyonun nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.