Işık Mikroskopisi için Histolojik Örnek Hazırlama
Histoloji, dokuların ve hücrelerin mikroskobik anatomisinin incelenmesini ifade eden bir terimdir. Işık mikroskobu için uygun histolojik numune hazırlama işlemi, doku örneklerinden kaliteli sonuçlar elde etmek için esastır.
Hemen hemen tüm histolojik prosedürler için ortak olan 3 ana adım vardır. İlk olarak, dokuyu korumak ve doku bozulmasını yavaşlatmak için numune fikse edilir. Ardından numune, kendisiyle benzer mekanik özelliklere sahip bir materyale veya gömme ortamına daldırılır. Gömme işlemi tamamlandıktan sonra numune, mikrotom olarak bilinen hassas bir kesme aracı kullanılarak ince dilimler halinde kesilir. Bu video, bu genel adımları ve bunlarla ilgili bazı kavramları açıklamaktadır.
Doku fiksasyonu, hücre ve doku bileşenlerini koruyan ve yapılarını muhafaza eden kritik bir adımdır. Hücre ölümünü takiben, hücresel organellerden doğal olarak oluşan enzimler salınır ve hücre boyunca proteinleri ve hücre dışı matrisi degrade etmeye başlayarak hücrenin yapısını bozar. Fiksasyon, bu enzimlerin proteinleri sindirme yeteneğini doğrudan inhibe ederek ve enzim kesim bölgelerini tanınmaz hale getirerek böyle bir degradasyonu önler.
Fiksasyonun iki ana mekanizması çapraz bağlanma ve koagülasyondur. Çapraz bağlanma, proteinlerin hem kendi içlerinde hem de birbirleri arasında kovalent bağ oluşumunu içerir; bu da dokunun sertleşmesine ve dolayısıyla degradasyona karşı direnç kazanmasına neden olur. Koagülasyon, alkoller veya aseton kullanımıyla proteinlerin dehidrasyonu sonucu oluşur; bu durum protein tersiyer yapısını deforme ederek hidrofobik (sudan kaçınan) bölgelerin protein yüzeyine taşınmasına yol açar. Koagülatif fiksasyon, parafin mumu gibi gömme ortamlarının dokuya nüfuz etmesine yardımcı olabilir.
En yaygın kullanılan fiksatiflerden biri, su içinde çözünmüş formaldehit olan Formalin'dir. Fiksasyon sırasında formaldehit, metilen köprüsü adı verilen kararlı bir çapraz bağ oluşturmak için lizin ve glutamin amino asitlerinin yan zincirlerinde bulunanlar gibi primer aminlere bağlanır. Bu süreç doğası gereği yavaştır ve 1-2 gün kadar sürebilir.
Fiksasyondan önce birkaç husus göz önünde bulundurulmalıdır. İlk olarak, örneğin difüzyon kabiliyetini değerlendirin. Fiksatifler, fiksatifin difüzyon katsayısının zamanın karekökü ile çarpımıyla ilişkili bir hızla dokular boyunca belirli bir mesafeye difüze olur. Örneğe 1 mm nüfuz etmesi 1 saat süren bir fiksatifin, 5 mm nüfuz etmesi 25 saat sürer. Formalin dokunun merkezine ulaştığında, çapraz bağlanma reaksiyonunun hala gerçekleşmesi gerekir. Bu nedenle, makul bir sürede eksiksiz fiksasyon için örnek kalınlığı 4 mm ile sınırlandırılmalıdır.
İkinci olarak, fiksatifin hacmini ve pH değerini değerlendirin. Reaktifin zamanla kolayca tükenmemesi için fiksatif-örnek hacim oranı en az 40:1 olmalıdır. Bazı fiksatifler asidik pH'da çalışacak şekilde tasarlanmış olsa da formalin, dokuda artefaktlara neden olan fazla asit üretimini önlemek ve nötral pH'ı korumak için fosfatla tamponlandığında en iyi sonucu verir.
Histolojik hazırlığın bir sonraki adımı, örneklerin kendisiyle benzer mekanik sertliğe sahip ortamlarda desteklendiği gömme işlemidir. Doğru gömme ortamının seçimi kritiktir; çünkü ortam çok sert veya çok yumuşak olursa, kesit alma sırasında defektler oluşabilir. Şu ana kadar gömme işlemi için en yaygın kullanılan ortam parafin mumudur.
Parafinle gömme işleminden önce örnekler, dokudaki suyun önce etanol, ardından ksilenler ve son olarak ısıtılmış parafin mumu ile değiştirilmesi yoluyla dehidre edilmelidir. Mum örneğe nüfuz ettikten sonra, bir kalıp kullanılarak örnek dikkatlice konumlandırılır ve bir blok oluşturmak için ek mumla çevrelenir. Ardından, örnekler kesit almak üzere bir doku kasetine yerleştirilir.
Kesit alma, bir gömme bloğundan örneğin ince dilimlerinin kesilmesi işlemidir. Kesitler, ışık mikroskobunda kullanılmak üzere genellikle 4-10 µm kalınlık civarındadır.
Kesitleri kesmek için, önce bir mikrotoma metal, cam veya elmas bir bıçak sabitlenir. Ardından örnek, bir örnek tutucuya yerleştirilir. Sonrasında örnek, kesme yüzeyine doğru ilerletilir ve istenen kalınlıkta bir dilim oluşturmak için bıçak üzerinden çekilir. Kesitler, lamların üzerine yerleştirilebilen ince şeritler halinde birikir.
Kesit alma işleminin ardından örnekler lamlara yerleştirilir. Parafine gömülmüş örnekler için dilimler önce ısıtılmış bir su banyosuna yerleştirilir ve ardından sudan çıkarılarak lam üzerine alınır ve kurumaya bırakılır.
Biyolojik dokuların doğal kontrastı çok düşüktür, bu nedenle histoloji sonrası slaytlar genellikle morfolojiyi veya spesifik proteinleri belirginleştiren boyalar veya antikorlarla boyanır. En yaygın olarak uygulanan boyama hematoksilin ve eozin veya H&E boyamasıdır. Çok yaygın olduğu için, çok sayıda kesiti H&E ile tekrarlanabilir şekilde boyamak amacıyla birçok otomatik cihaz geliştirilmiştir. Hematoksilin hücre çekirdeklerini maviye boyarken, eozin sitoplazmayı pembeye boyayarak dokuların hücresel morfolojisini ortaya çıkarır.
Fiksasyonun bir dezavantajı, proteinlerin çapraz bağlanmasının antikorların bağlanma bölgelerini bulmasını zorlaştırabilmesidir. Numuneleri korumak için fiksasyon kullanmak yerine, dokunun hızlıca dondurulması (şok dondurma) yöntemi kullanılabilir ve bunu kriyoseksiyon olarak adlandırılan bir kesme tekniği takip eder.
Doku örnekleri, OCT veya optimal kesme sıcaklığı ortamı olarak adlandırılan özel bir dondurma ortamına gömülür, yönlendirilir ve ardından hızla dondurulur. Diğer gömme ortamları gibi, OCT de numunenin sertliğiyle uyum sağlar.
Donmuş kesitleri almak için bir kriyomikrotom veya kriyostat kullanılır ve bu cihaz, kesme bıçağını ve numuneleri soğuk tutmak için -20°C'lik bir iç sıcaklığı korur. Parafinle gömülmüş kesitlerin aksine, donmuş kesitler kesimden hemen sonra doğrudan pozitif yüklü bir cam slayt üzerine alınabilir.
Fiksasyondan kaçınmanın bir başka yolu da, numunelerin taze hazırlanmış sıvı agaroz ile kaplandığı agar gömme yöntemidir. Agaroz soğudukça dokuyu sabitler ve fazla agaroz kenarlardan budanabilir.
Mikrotoma alternatif bir diğer yöntem olan vibrotomlar, agarozla gömülmüş numune üzerinde hareket eden ve titreşen bir bıçağa sahiptir. Vibrotomlar, agarozla gömülmüş numunelerden 50-1000 µm mertebesinde kalın kesitler oluşturmak için kullanılır.
Numuneler genellikle boyamadan önce agarozdan çıkarılır ve ardından lamine camın numuneyi ezmesini önleyen vakum gresi gibi bir madde ile çevrelenerek bir slayt üzerine yerleştirilir. Her bir kalın kesitin yüksek çözünürlüklü görüntülerini elde etmek için konfokal mikroskopi kullanılarak incelenmeleri en uygunudur.
JoVE'nin ışık mikroskobisi için histolojik numune hazırlama konusundaki videosunu izlediniz.
Artık bir doku parçasından boyanabilir bir kesite ulaşmak için numune hazırlama sürecinde yer alan adımları anlamış olmalısınız. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
Histoloji, genellikle bir ışık mikroskobunun kullanımıyla desteklenen, hücrelerin ve dokuların incelenmesidir. Histolojik örneklerin hazırlanması; boy…
Histoloji, dokuların ve hücrelerin mikroskobik anatomisinin incelenmesini ifade eden bir terimdir. Işık mikroskobu için uygun histolojik numune hazırlama işlemi, doku örneklerinden kaliteli sonuçlar elde etmek için esastır.
Hemen hemen tüm histolojik prosedürler için ortak olan 3 ana adım vardır. İlk olarak, dokuyu korumak ve doku bozulmasını yavaşlatmak için numune fikse edilir. Ardından numune, kendisiyle benzer mekanik özelliklere sahip bir materyale veya gömme ortamına daldırılır. Gömme işlemi tamamlandıktan sonra numune, mikrotom olarak bilinen hassas bir kesme aracı kullanılarak ince dilimler halinde kesilir. Bu video, bu genel adımları ve bunlarla ilgili bazı kavramları açıklamaktadır.
Doku fiksasyonu, hücre ve doku bileşenlerini koruyan ve yapılarını muhafaza eden kritik bir adımdır. Hücre ölümünü takiben, hücresel organellerden doğal olarak oluşan enzimler salınır ve hücre boyunca proteinleri ve hücre dışı matrisi degrade etmeye başlayarak hücrenin yapısını bozar. Fiksasyon, bu enzimlerin proteinleri sindirme yeteneğini doğrudan inhibe ederek ve enzim kesim bölgelerini tanınmaz hale getirerek böyle bir degradasyonu önler.
Fiksasyonun iki ana mekanizması çapraz bağlanma ve koagülasyondur. Çapraz bağlanma, proteinlerin hem kendi içlerinde hem de birbirleri arasında kovalent bağ oluşumunu içerir; bu da dokunun sertleşmesine ve dolayısıyla degradasyona karşı direnç kazanmasına neden olur. Koagülasyon, alkoller veya aseton kullanımıyla proteinlerin dehidrasyonu sonucu oluşur; bu durum protein tersiyer yapısını deforme ederek hidrofobik (sudan kaçınan) bölgelerin protein yüzeyine taşınmasına yol açar. Koagülatif fiksasyon, parafin mumu gibi gömme ortamlarının dokuya nüfuz etmesine yardımcı olabilir.
En yaygın kullanılan fiksatiflerden biri, su içinde çözünmüş formaldehit olan Formalin'dir. Fiksasyon sırasında formaldehit, metilen köprüsü adı verilen kararlı bir çapraz bağ oluşturmak için lizin ve glutamin amino asitlerinin yan zincirlerinde bulunanlar gibi primer aminlere bağlanır. Bu süreç doğası gereği yavaştır ve 1-2 gün kadar sürebilir.
Fiksasyondan önce birkaç husus göz önünde bulundurulmalıdır. İlk olarak, örneğin difüzyon kabiliyetini değerlendirin. Fiksatifler, fiksatifin difüzyon katsayısının zamanın karekökü ile çarpımıyla ilişkili bir hızla dokular boyunca belirli bir mesafeye difüze olur. Örneğe 1 mm nüfuz etmesi 1 saat süren bir fiksatifin, 5 mm nüfuz etmesi 25 saat sürer. Formalin dokunun merkezine ulaştığında, çapraz bağlanma reaksiyonunun hala gerçekleşmesi gerekir. Bu nedenle, makul bir sürede eksiksiz fiksasyon için örnek kalınlığı 4 mm ile sınırlandırılmalıdır.
İkinci olarak, fiksatifin hacmini ve pH değerini değerlendirin. Reaktifin zamanla kolayca tükenmemesi için fiksatif-örnek hacim oranı en az 40:1 olmalıdır. Bazı fiksatifler asidik pH'da çalışacak şekilde tasarlanmış olsa da formalin, dokuda artefaktlara neden olan fazla asit üretimini önlemek ve nötral pH'ı korumak için fosfatla tamponlandığında en iyi sonucu verir.
Histolojik hazırlığın bir sonraki adımı, örneklerin kendisiyle benzer mekanik sertliğe sahip ortamlarda desteklendiği gömme işlemidir. Doğru gömme ortamının seçimi kritiktir; çünkü ortam çok sert veya çok yumuşak olursa, kesit alma sırasında defektler oluşabilir. Şu ana kadar gömme işlemi için en yaygın kullanılan ortam parafin mumudur.
Parafinle gömme işleminden önce örnekler, dokudaki suyun önce etanol, ardından ksilenler ve son olarak ısıtılmış parafin mumu ile değiştirilmesi yoluyla dehidre edilmelidir. Mum örneğe nüfuz ettikten sonra, bir kalıp kullanılarak örnek dikkatlice konumlandırılır ve bir blok oluşturmak için ek mumla çevrelenir. Ardından, örnekler kesit almak üzere bir doku kasetine yerleştirilir.
Kesit alma, bir gömme bloğundan örneğin ince dilimlerinin kesilmesi işlemidir. Kesitler, ışık mikroskobunda kullanılmak üzere genellikle 4-10 µm kalınlık civarındadır.
Kesitleri kesmek için, önce bir mikrotoma metal, cam veya elmas bir bıçak sabitlenir. Ardından örnek, bir örnek tutucuya yerleştirilir. Sonrasında örnek, kesme yüzeyine doğru ilerletilir ve istenen kalınlıkta bir dilim oluşturmak için bıçak üzerinden çekilir. Kesitler, lamların üzerine yerleştirilebilen ince şeritler halinde birikir.
Kesit alma işleminin ardından örnekler lamlara yerleştirilir. Parafine gömülmüş örnekler için dilimler önce ısıtılmış bir su banyosuna yerleştirilir ve ardından sudan çıkarılarak lam üzerine alınır ve kurumaya bırakılır.
Biyolojik dokuların doğal kontrastı çok düşüktür, bu nedenle histoloji sonrası slaytlar genellikle morfolojiyi veya spesifik proteinleri belirginleştiren boyalar veya antikorlarla boyanır. En yaygın olarak uygulanan boyama hematoksilin ve eozin veya H&E boyamasıdır. Çok yaygın olduğu için, çok sayıda kesiti H&E ile tekrarlanabilir şekilde boyamak amacıyla birçok otomatik cihaz geliştirilmiştir. Hematoksilin hücre çekirdeklerini maviye boyarken, eozin sitoplazmayı pembeye boyayarak dokuların hücresel morfolojisini ortaya çıkarır.
Fiksasyonun bir dezavantajı, proteinlerin çapraz bağlanmasının antikorların bağlanma bölgelerini bulmasını zorlaştırabilmesidir. Numuneleri korumak için fiksasyon kullanmak yerine, dokunun hızlıca dondurulması (şok dondurma) yöntemi kullanılabilir ve bunu kriyoseksiyon olarak adlandırılan bir kesme tekniği takip eder.
Doku örnekleri, OCT veya optimal kesme sıcaklığı ortamı olarak adlandırılan özel bir dondurma ortamına gömülür, yönlendirilir ve ardından hızla dondurulur. Diğer gömme ortamları gibi, OCT de numunenin sertliğiyle uyum sağlar.
Donmuş kesitleri almak için bir kriyomikrotom veya kriyostat kullanılır ve bu cihaz, kesme bıçağını ve numuneleri soğuk tutmak için -20°C'lik bir iç sıcaklığı korur. Parafinle gömülmüş kesitlerin aksine, donmuş kesitler kesimden hemen sonra doğrudan pozitif yüklü bir cam slayt üzerine alınabilir.
Fiksasyondan kaçınmanın bir başka yolu da, numunelerin taze hazırlanmış sıvı agaroz ile kaplandığı agar gömme yöntemidir. Agaroz soğudukça dokuyu sabitler ve fazla agaroz kenarlardan budanabilir.
Mikrotoma alternatif bir diğer yöntem olan vibrotomlar, agarozla gömülmüş numune üzerinde hareket eden ve titreşen bir bıçağa sahiptir. Vibrotomlar, agarozla gömülmüş numunelerden 50-1000 µm mertebesinde kalın kesitler oluşturmak için kullanılır.
Numuneler genellikle boyamadan önce agarozdan çıkarılır ve ardından lamine camın numuneyi ezmesini önleyen vakum gresi gibi bir madde ile çevrelenerek bir slayt üzerine yerleştirilir. Her bir kalın kesitin yüksek çözünürlüklü görüntülerini elde etmek için konfokal mikroskopi kullanılarak incelenmeleri en uygunudur.
JoVE'nin ışık mikroskobisi için histolojik numune hazırlama konusundaki videosunu izlediniz.
Artık bir doku parçasından boyanabilir bir kesite ulaşmak için numune hazırlama sürecinde yer alan adımları anlamış olmalısınız. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
Histoloji, dokuların ve hücrelerin mikroskobik anatomisinin incelenmesini ifade eden bir terimdir. Işık mikroskobu için uygun histolojik numune hazırlama işlemi, doku örneklerinden kaliteli sonuçlar elde etmek için esastır.
Hemen hemen tüm histolojik prosedürler için ortak olan 3 ana adım vardır. İlk olarak, dokuyu korumak ve doku bozulmasını yavaşlatmak için numune fikse edilir. Ardından numune, kendisiyle benzer mekanik özelliklere sahip bir materyale veya gömme ortamına daldırılır. Gömme işlemi tamamlandıktan sonra numune, mikrotom olarak bilinen hassas bir kesme aracı kullanılarak ince dilimler halinde kesilir. Bu video, bu genel adımları ve bunlarla ilgili bazı kavramları açıklamaktadır.
Doku fiksasyonu, hücre ve doku bileşenlerini koruyan ve yapılarını muhafaza eden kritik bir adımdır. Hücre ölümünü takiben, hücresel organellerden doğal olarak oluşan enzimler salınır ve hücre boyunca proteinleri ve hücre dışı matrisi degrade etmeye başlayarak hücrenin yapısını bozar. Fiksasyon, bu enzimlerin proteinleri sindirme yeteneğini doğrudan inhibe ederek ve enzim kesim bölgelerini tanınmaz hale getirerek böyle bir degradasyonu önler.
Fiksasyonun iki ana mekanizması çapraz bağlanma ve koagülasyondur. Çapraz bağlanma, proteinlerin hem kendi içlerinde hem de birbirleri arasında kovalent bağ oluşumunu içerir; bu da dokunun sertleşmesine ve dolayısıyla degradasyona karşı direnç kazanmasına neden olur. Koagülasyon, alkoller veya aseton kullanımıyla proteinlerin dehidrasyonu sonucu oluşur; bu durum protein tersiyer yapısını deforme ederek hidrofobik (sudan kaçınan) bölgelerin protein yüzeyine taşınmasına yol açar. Koagülatif fiksasyon, parafin mumu gibi gömme ortamlarının dokuya nüfuz etmesine yardımcı olabilir.
En yaygın kullanılan fiksatiflerden biri, su içinde çözünmüş formaldehit olan Formalin'dir. Fiksasyon sırasında formaldehit, metilen köprüsü adı verilen kararlı bir çapraz bağ oluşturmak için lizin ve glutamin amino asitlerinin yan zincirlerinde bulunanlar gibi primer aminlere bağlanır. Bu süreç doğası gereği yavaştır ve 1-2 gün kadar sürebilir.
Fiksasyondan önce birkaç husus göz önünde bulundurulmalıdır. İlk olarak, örneğin difüzyon kabiliyetini değerlendirin. Fiksatifler, fiksatifin difüzyon katsayısının zamanın karekökü ile çarpımıyla ilişkili bir hızla dokular boyunca belirli bir mesafeye difüze olur. Örneğe 1 mm nüfuz etmesi 1 saat süren bir fiksatifin, 5 mm nüfuz etmesi 25 saat sürer. Formalin dokunun merkezine ulaştığında, çapraz bağlanma reaksiyonunun hala gerçekleşmesi gerekir. Bu nedenle, makul bir sürede eksiksiz fiksasyon için örnek kalınlığı 4 mm ile sınırlandırılmalıdır.
İkinci olarak, fiksatifin hacmini ve pH değerini değerlendirin. Reaktifin zamanla kolayca tükenmemesi için fiksatif-örnek hacim oranı en az 40:1 olmalıdır. Bazı fiksatifler asidik pH'da çalışacak şekilde tasarlanmış olsa da formalin, dokuda artefaktlara neden olan fazla asit üretimini önlemek ve nötral pH'ı korumak için fosfatla tamponlandığında en iyi sonucu verir.
Histolojik hazırlığın bir sonraki adımı, örneklerin kendisiyle benzer mekanik sertliğe sahip ortamlarda desteklendiği gömme işlemidir. Doğru gömme ortamının seçimi kritiktir; çünkü ortam çok sert veya çok yumuşak olursa, kesit alma sırasında defektler oluşabilir. Şu ana kadar gömme işlemi için en yaygın kullanılan ortam parafin mumudur.
Parafinle gömme işleminden önce örnekler, dokudaki suyun önce etanol, ardından ksilenler ve son olarak ısıtılmış parafin mumu ile değiştirilmesi yoluyla dehidre edilmelidir. Mum örneğe nüfuz ettikten sonra, bir kalıp kullanılarak örnek dikkatlice konumlandırılır ve bir blok oluşturmak için ek mumla çevrelenir. Ardından, örnekler kesit almak üzere bir doku kasetine yerleştirilir.
Kesit alma, bir gömme bloğundan örneğin ince dilimlerinin kesilmesi işlemidir. Kesitler, ışık mikroskobunda kullanılmak üzere genellikle 4-10 µm kalınlık civarındadır.
Kesitleri kesmek için, önce bir mikrotoma metal, cam veya elmas bir bıçak sabitlenir. Ardından örnek, bir örnek tutucuya yerleştirilir. Sonrasında örnek, kesme yüzeyine doğru ilerletilir ve istenen kalınlıkta bir dilim oluşturmak için bıçak üzerinden çekilir. Kesitler, lamların üzerine yerleştirilebilen ince şeritler halinde birikir.
Kesit alma işleminin ardından örnekler lamlara yerleştirilir. Parafine gömülmüş örnekler için dilimler önce ısıtılmış bir su banyosuna yerleştirilir ve ardından sudan çıkarılarak lam üzerine alınır ve kurumaya bırakılır.
Biyolojik dokuların doğal kontrastı çok düşüktür, bu nedenle histoloji sonrası slaytlar genellikle morfolojiyi veya spesifik proteinleri belirginleştiren boyalar veya antikorlarla boyanır. En yaygın olarak uygulanan boyama hematoksilin ve eozin veya H&E boyamasıdır. Çok yaygın olduğu için, çok sayıda kesiti H&E ile tekrarlanabilir şekilde boyamak amacıyla birçok otomatik cihaz geliştirilmiştir. Hematoksilin hücre çekirdeklerini maviye boyarken, eozin sitoplazmayı pembeye boyayarak dokuların hücresel morfolojisini ortaya çıkarır.
Fiksasyonun bir dezavantajı, proteinlerin çapraz bağlanmasının antikorların bağlanma bölgelerini bulmasını zorlaştırabilmesidir. Numuneleri korumak için fiksasyon kullanmak yerine, dokunun hızlıca dondurulması (şok dondurma) yöntemi kullanılabilir ve bunu kriyoseksiyon olarak adlandırılan bir kesme tekniği takip eder.
Doku örnekleri, OCT veya optimal kesme sıcaklığı ortamı olarak adlandırılan özel bir dondurma ortamına gömülür, yönlendirilir ve ardından hızla dondurulur. Diğer gömme ortamları gibi, OCT de numunenin sertliğiyle uyum sağlar.
Donmuş kesitleri almak için bir kriyomikrotom veya kriyostat kullanılır ve bu cihaz, kesme bıçağını ve numuneleri soğuk tutmak için -20°C'lik bir iç sıcaklığı korur. Parafinle gömülmüş kesitlerin aksine, donmuş kesitler kesimden hemen sonra doğrudan pozitif yüklü bir cam slayt üzerine alınabilir.
Fiksasyondan kaçınmanın bir başka yolu da, numunelerin taze hazırlanmış sıvı agaroz ile kaplandığı agar gömme yöntemidir. Agaroz soğudukça dokuyu sabitler ve fazla agaroz kenarlardan budanabilir.
Mikrotoma alternatif bir diğer yöntem olan vibrotomlar, agarozla gömülmüş numune üzerinde hareket eden ve titreşen bir bıçağa sahiptir. Vibrotomlar, agarozla gömülmüş numunelerden 50-1000 µm mertebesinde kalın kesitler oluşturmak için kullanılır.
Numuneler genellikle boyamadan önce agarozdan çıkarılır ve ardından lamine camın numuneyi ezmesini önleyen vakum gresi gibi bir madde ile çevrelenerek bir slayt üzerine yerleştirilir. Her bir kalın kesitin yüksek çözünürlüklü görüntülerini elde etmek için konfokal mikroskopi kullanılarak incelenmeleri en uygunudur.
JoVE'nin ışık mikroskobisi için histolojik numune hazırlama konusundaki videosunu izlediniz.
Artık bir doku parçasından boyanabilir bir kesite ulaşmak için numune hazırlama sürecinde yer alan adımları anlamış olmalısınız. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: Why is tissue fixation necessary in histological sample preparation?
Tissue fixation preserves cell and tissue structure by preventing degradation caused by naturally occurring enzymes released after cell death. Fixation inhibits enzyme activity and makes protein cleavage sites unrecognizable. The two main mechanisms are cross-linking, which forms covalent bonds to stiffen tissue, and coagulation, which dehydrates proteins using alcohols or acetone to deform their structure.
Q2: What are the two main mechanisms of tissue fixation?
Cross-linking involves covalent bond formation within and between proteins, causing tissue to stiffen and resist degradation. Coagulation dehydrates proteins through alcohols or acetone, deforming their tertiary structure so hydrophobic regions move to the protein surface. Coagulative fixation helps embedding media like paraffin wax penetrate tissue more effectively.
Q3: How does formalin work as a fixative in tissue preparation?
Formalin, formaldehyde dissolved in water, attaches to primary amines on amino acid side chains like lysine and glutamine, forming stable crosslinks called methylene bridges. This cross-linking process is inherently slow, requiring 1-2 days for completion. Formalin works best when buffered with phosphate to maintain neutral pH and prevent tissue artifacts.
Q4: What factors should be considered before tissue fixation begins?
Consider sample diffusivity: fixatives penetrate tissue at rates related to diffusion coefficient and time, so samples should be limited to 4 mm thickness for thorough fixation. Also consider fixative volume and pH. The fixative-to-sample ratio should be at least 40:1 to prevent reagent depletion. Formalin should be buffered with phosphate to maintain neutral pH and avoid tissue artifacts.
Q5: What is the purpose of embedding media in histological preparation?
Embedding media supports specimens with mechanical rigidity similar to the tissue itself. Paraffin wax is the most common embedding medium. Choosing appropriate embedding media is critical because media that is too stiff or too weak causes sectioning defects. Prior to paraffin embedding, samples must be dehydrated by replacing water with ethanol, then xylenes, and finally warmed paraffin wax.
Q6: How does cryosectioning differ from traditional paraffin-embedded sectioning?
Cryosectioning avoids fixation by rapidly freezing tissue in OCT (optimal cutting temperature) medium, then sectioning with a cryomicrotome maintained at -20°C. Unlike paraffin sections that require water bath treatment, frozen sections are directly lifted onto positively charged glass slides immediately after sectioning. This method preserves protein structure better for antibody labeling since cross-linking does not occur.
Q7: What are alternative embedding methods to paraffin wax?
Agar embedding covers samples with freshly prepared liquid agarose that locks tissue in place as it cools. Vibrotomes with vibrating blades cut thick sections of 50-1000 µm from agarose-embedded samples. Samples are typically removed from agarose before staining and mounted on slides with vacuum grease. Thick agarose sections are best viewed using light microscopy principle instrumentation and applications for high-resolution imaging.
Bu videodaki bölümler
0:00
Overview
1:05
Fixation of Tissue Samples
4:19
Embedding and Sectioning
6:12
Applications
9:01
Summary