Kültür farklılaştırılmış insan Neuroprogenitor Hücreler Nöronlar Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bir insan nöronal kültür modeli geliştirmek, nöronal belirteçleri tanımlamak ve gen ekspresyonu analizi için saf bir nöron popülasyonunu izole etmektir. Bu, sürekli bir progenitör hücre kaynağı oluşturmak için önce insan nöro progenitör hücrelerinin genişletilmesiyle elde edilir. İkinci adım olarak, nöro progenitör hücreler, bağlanma faktörleri ile kaplanmış tabaklarda farklılaşma takviyeleri ve nörotrofik büyüme faktörlerinin varlığında kültürlenir.

Daha sonra, farklılaşmış nöro progenitör hücrelerin kaderini belirlemek için nöronal belirteçler için immünofloresan boyama yapılır. Son olarak, nörona özgü gen ekspresyon analizini kolaylaştırmak için PEN membran slaytları üzerinde kültürlenen nöronların lazer yakalama mikrodiseksiyonu gerçekleştirilir. Farklılaşmış nöro progenitör hücrelerin doğada ağırlıklı olarak nöronal olduğunu gösteren sonuçlar elde edilir.

İmmünofloresan boyamaya ve nöronların yakalanmasına dayanır. Lazer yakalama mikrodiseksiyonu ile, insan nöro progenitör hücreleri genişletilebilir ve nöron açısından zengin kültürlere farklılaştırılabilir. İn vitro çalışmalar için, bu kültürler bazı gal hücrelerine sahip olduğundan, saf bir nöron popülasyonunu izole etmek için lazer yakalama mikro diseksiyonunu kullanabiliriz.

Bu prosedürleri göstermek, mikroskop çekirdek tesisimizde kıdemli bir araştırma görevlisi olan Ron Bouchard olacaktır. Bu prosedüre başlamak için, fetal beyinden izole edilen donmuş bir insan nöro progenitör hücre stoğunu hızlı bir şekilde 37 santigrat dereceye ısıtarak canlandırın ve daha sonra bunları mililitre başına 10 nanogram ile desteklenmiş 15 mililitre ön ısıtma nöro bazal ortam içeren bir T 75'e ekleyin, EG, F ve FGF. Hücreleri üç gün boyunca kültürledikten sonra, nörosferleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve santrifüjlemeyi takiben beş dakika boyunca 1000 RPM'de santrifüjleme ile peletleyin, süpernatanı atın, yaklaşık 100 mikrolitre ortamı geride bırakın ve hücre peletini bir einor tüpüne aktarın.

100 mikrolitrelik bir hücre peleti, iki T 75 şişesine bölmek için yeterlidir. Daha az ise, nöro progenitör hücreler çoğalamadığı için şişe sayısını azaltın. İnce bölünürse, 200 mikrolitrelik ucu tüpün dibine karşı tutarken 50 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek nörosferleri tek hücreli bir süspansiyona iyice ayırın.

Nörosferlerin ayrılmasını sağlamak için bir mikroskop kullanarak ilerlemeyi görsel olarak kontrol edin. Ardından, hücre süspansiyonunu eşit olarak bölün ve iki T 75 şişesine ekleyin. Biri sürekli genişleme için, diğeri ise farklılaşma için.

Sonra şişeleri inkübe edin. Santrifüjleme ile genişleme için işaretlenen şişedeki nöro progenitör hücrelerin ortamını değiştirin. Ardından eski ortamı atın ve yeni ortam ekleyin.

Nörosferler 300 ila 500 mikron olan orijinal boyutlarına ulaşana kadar ortamı her dört ila beş günde bir değiştirin. Nöro progenitörlerin nöron açısından zengin bir kültüre hücre farklılaşmasına başlamak için, 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna tek bir kapak kaymağı yerleştirin ve her birine mililitre poli L lizin başına 500 mikrolitre 100 mikrogram ekleyerek kaplayın. Bulaşıkları oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin, ardından poliol lizin çözeltisini aspire edin.

Plakayı deiyonize steril su ile durulayın ve tekrar aspire edin. Daha sonra, plakanın kuyularını mililitre başına 500 mikrolitre beş mikrogram, fare laminini ile kaplayın ve inkübasyonu takiben 30 dakika inkübe edin, kuyuları tekrar PBS aspiratı ile yıkayın ve doku kültürü davlumbazında kurumaya bırakın. Hücreleri ayırdıktan dört gün sonra, küçük nöroküreleri farklılaşma için etiketlenmiş şişeden kaplanmış 24 oyuklu plakaya aktarın.

Nöroküreler tabağa bağlandığında altı saat inkübe ettikten sonra kuyu başına yaklaşık 500 nöroküre yoğunluğu ekleyin, proliferasyon ortamını çıkarın ve farklılaşma ekleyin. Nöro bazal ortam B 27 takviyesi, N-G-F-B-D-N-F-D-B-C ve retinoik asitten oluşan ortam. Nöronal farklılaşma ortamında nöro progenitör hücrelerin kültürünü takiben iki hafta boyunca plakayı inkübatöre geri koyun, nöron açısından zengin bir kültür elde edilir.

Nöronları PBS'de bir kez durulayın ve ardından 30 dakika boyunca% 4 paraform aldehit içinde sabitleyin. Sabitlendikten sonra, hücreleri PBS ile üç kez durulayın. Daha sonra hücreleri oda sıcaklığında geçirgen tampon ile 60 dakika inkübe ederek immüno-boyama için hazırlayın.

Daha sonra, kuyucuklara PBS'de% 3 BSA'da poliklonal ve monoklonal antikorlar ekleyin. Her birine farklı bir antikor çifti ekleyerek, ertesi sabah bir çalkalayıcıda gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Kapak fişlerini PBS ile üç kez yıkayın ve daha sonra inkübasyonu takiben 90 dakika boyunca karanlıkta oda sıcaklığında anti tavşan P SI üç ve anti-US fitzy ikincil antikorlarla inkübe edin.

Kapak fişlerini PBS ile üç kez yıkayın. Ardından 10 mikrolitre montaj ortamını bir cam kızak üzerine yerleştirin. Kapak fişini kültür kabından çıkarın ve montaj ortamının üzerine baş aşağı yerleştirin.

Fazla montaj ortamını nazikçe silin ve kenarları oje ile kapatın. Hücreleri önce mikrodiseksiyona hazırlamak için, nöro progenitör hücreleri PEN membranı üzerinde nöron açısından zengin bir kültüre farklılaştırın. Poli L lizin ve laminin ile kaplanmış slaytlar.

Sonraki tüm adımları RNA içermeyen koşullar altında gerçekleştirin. Daha sonra, hücreleri görselleştirmek için histo gen boyasını kullanarak kültürleri boyayın, histo geni çekirdekleri mor ve sitoplazmayı açık pembe boyar, bu da nöronları ve glial hücreleri farklı morfolojilerine göre ayırt etmeyi kolaylaştırır. Slaytı 30 saniye boyunca %75 etanol ve deiyonize steril suya yerleştirin.

Ardından slaytı bir Kim mendilinin üzerine yerleştirin. 200 mikrolitre histo geni ekleyin ve 20 saniye bekleyin. Ardından, slaytı deiyonize steril su, %75 etanol, %95 etanol ve %100 etanol içine 30 saniye boyunca sırayla yerleştirin.

Daha sonra beş dakika ksilen içine koyun ve beş dakika boyunca bir Kim mendili üzerinde kurulayın. Ardından, normal slaytın üzerine bir PEN membran Slaytı yerleştirin ve yazılımı kullanarak Veritas lazer yakalama mikro diseksiyon sistemine veya LCM'ye yerleştirin. Astrositlerden yoksun saf nöronal popülasyonların alanlarını bulmak için bir yol haritası görüntüsü alın.

Çizim araçlarını kullanarak bu nöronları işaretleyin. Ardından, iki aşamalı bir işlemde bilgisayar kontrollü hassasiyet ve otomasyon kullanarak bu alanların lazerle yakalanmasını sağlayın. İlk olarak, IR, zarı kapağa tutturmak için 70 miliwatt'lık bir lazer gücü ayarı ve 2.500 mikrosaniyelik bir darbe ile birden fazla noktada ateşlenir.

Daha sonra, işaretlenen alan, 10 milivoltluk düşük bir seviye ayarında bir UV kesme aleti kullanılarak eksize edilir. Bu işlemlerin kombinasyonu, işaretli alanları seçici olarak yakalar ve LCM makro kapaklarını yakalar. En az 100 nöron yakalandığında, zarı kapaktan çıkarmak ve bir tüpe yerleştirmek için bir mikroskop kullanın.

Bir P OPU RNA izolasyon kiti kullanarak LCM örneklerinden toplam RNA'yı izole edin ve DNA'larla tedavi edin. Ardından, kitteki talimatları izleyerek ribo amp RNA amplifikasyon kitini kullanarak izole edilmiş RNA'yı amplifiye edin. Son olarak, insan nörofilament ağır zincirini tespit etmek için TAC MAN problarını kullanarak gerçek zamanlı R-T-P-C-R analizi gerçekleştirin.

Nöron açısından zengin bir kültür, farklılaşmaya özgü büyüme faktörleri ile kombinasyon halinde poli L, lizin ve laminat kaplı yüzeyler kullanılarak dört günlük nörosferlerin farklılaştırılmasıyla elde edilir. İki hafta sonra, düşük yoğunluklu alanlarda burada gösterilen nöron açısından zengin bir kültür elde edilir. Hücreler, burada görülenler gibi astrositlere farklılaşabilir.

Astrosit farklılaşması, nöron farklılaşması için kullanılanlar yerine büyüme faktörü CNTF kullanılarak da yönlendirilebilir. Nöron farklılaşması, spesifik nöronal belirteçlere, yeni N ve sinapsin, asetilkolinesteraz ve sinaptofizin ve BDNF ve GAAP'ye karşı antikorlar kullanılarak tanımlanabilir 43 Pozitif boyama, farklılaşmış hücrelerin birincil nöronların özelliklerine sahip olduğunun kanıtıdır. Ek olarak, astrositler pozitif stat üç ve GAP immün boyama yoluyla tanımlanabilir.

Nöronların lazer yakalama mikrodiseksiyonu, poli L lizin ve laminin kaplı PEN membran üzerinde farklılaşmış hücreler üzerinde gerçekleştirilir Burada gösterilen slaytlar, histo boyama ile boyanmış nöronlardır. Hücreleri görselleştirmek için, ilgilenilen hücreler daha sonra PEN zarını eriten ve üzerine yerleştirilen yakalama kapağına yapışmasına neden olan bir lazer kullanılarak ana hatları çizilebilir. Sonunda, çok sayıda hücre ana hatlarıyla belirtilebilir ve DNA veya RNA analizi için aynı kapağa yakalanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, lazer yakalama mikrodiseksiyonu kullanarak nöronları nasıl izole edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.