Hücre Pasajlama
Hücrelerin pasajlanması veya alt kültürlerinin oluşturulması, belirli bir kültürdeki hücrelerin yeni kültürlere bölünmesi veya "ayrılması" ve daha fazla genişlemeyi kolaylaştırmak için taze besiyeri ile beslendiği yaygın bir işlemdir. Kavramın kendisi nispeten basit olsa da, bu videoda hücre hatlarının başarılı bir şekilde sürdürülmesi ve genişletilmesi için gereken bazı önemli adımları ele alacağız.
Toksik metabolitler zamanla hücre kültürü ortamında birikir. Hücre genişletme işlemleri sırasında, hücre sağlığını korumak için ortamın düzenli olarak değiştirilmesi ve hücrelerin aşırı büyümesini önlemek için hücre genişlemesinin izlenmesi özellikle önemlidir.
Genellikle iki ana hücre tipi subkültür yapılır: ölümsüzleştirilmiş hücre hatları ve kök hücre hatları
Ölümsüzleştirilmiş hücre hatları, hücre döngüsü düzenlemelerini etkileyen bir mutasyon geçirmiş ve bu sayede süresiz olarak çoğalabilen çok hücreli organizmalardan türetilen hücrelerdir. Belki de en ünlü ölümsüzleştirilmiş hücre hattı, 1951 yılında Bayan Henrietta Lacks'ten alınan bir biyopside saptanan serviks kanseri lezyonundan türetilen HeLa hücre hattıdır.
Kanser nedeniyle ölümsüzleştirilen hücre hatlarının aksine, kök hücre hatları hem yetişkin hem de embriyonik dokulardan, çeşitli dokulardan kendi kendini yenileyebilen ve multipotent hücrelerin izole edilmesiyle oluşturulur. Uygun koşullar altında, burada gördüğünüz insan embriyonik kök hücreleri gibi bu hücreler kültürde süresiz olarak tutulabilir.
Hücreler ya kandan izole edilen ölümsüzleştirilmiş hücreler gibi süspansiyonda optimal şekilde kültüre edilirler ya da birçok doku kaynaklı hücrede olduğu gibi bir yüzeye yapıştıklarında en iyi şekilde büyürler.
Hücre sağlığını sağlamak için bu yapışkan hücrelerin büyümesi yakından izlenmelidir. Hücre tipine bağlı olarak, çoğu yapışkan hücre %70-90 konfluens düzeyine ulaştığında, yani kültür kabı yüzeyinin %70-90'ını kapladığında pasajlanmalıdır.
Hücre hatlarının orijinal hücre kültürünün birçok özelliğini koruduğunu, ancak her ardışık pasajla birlikte genişletilmiş kültüre özgü özellikler kazanmaya başlayabileceklerini unutmayın. Bu nedenle, tek bir hücre kültürünü pasajlama sayınızı sınırlandırmayı düşünün.
Hücre pasajlama işlemi sırasında, steril tekniklerin yanı sıra uygun reaktiflerin ve ekipmanların kullanılması önemlidir.
Hücre hattınızın optimal büyümesi ve ekspansiyonu için uygun medyumların kullanılması esastır. Her hücre hattı spesifik bir büyüme takviyesi kokteyli gerektirecektir; ancak çoğu hücre hattı en azından şunlarla takviye edilmelidir: Bovine komplemanı inaktive etmek için ısıtılmış olması gereken ve hücreler için hayati büyüme faktörleri sağlayan Fetal Bovine Serum gibi bir serum, kültürde kontaminasyon büyümesini sınırlamaya yardımcı olan penisilin ve streptomisin gibi antibiyotikler ve hücre hatlarının büyüme ve ekspansiyon süresini uzatmaya yardımcı olan fibroblast büyüme faktörü gibi diğer büyüme faktörleri. Takviyeli veya "tam" hücre kültürü medyumlarını kullanmadığınız zamanlarda 4 C'de saklayın.
İlk olarak, doku kültürü medyumunun rengine dikkat edin. Taze hücre kültürü medyumları besin açısından zengindir ve kısmen pH indikatörü olan fenol kırmızı eklenmesi nedeniyle berrak, turuncu bir renkte görünür.
Hücreler medyumdaki besinleri tüketmeye başladığında, hücre kültüründe atıklar ve asit birikmeye başlayarak pH değerini düşürür. Bu nedenle, birçok doku kültürü medyumu, hücreler kültürü asidik hale getirdiğinde medyumun rengini turuncudan sarıya çeviren fenol kırmızı içerir. Medyum bu renge dönmeden önce değiştirin!
Fenol kırmızı medyumun rengini pembemsi bir renge çevirdiğinde, bu durum pH'ın sağlıklı hücre büyümesi için çok bazik hale geldiğini gösterir; bu durumda hem CO2 tankınızı hem de medyumunuzu değiştirme zamanı gelmiş olabilir.
Çoğu adherent hücre hattı, kaplanmamış plastiğe doğal olarak tutunur. Bu nedenle, petri kapları veya 6 kuyucuklu plakalar gibi plastik hücre kültürü plakaları, hücrelerin alt kültürlenmesi için sıklıkla kullanılır.
Plastik hücre kültürü flaskları da kullanılır. Örneğin, T25 hücre kültürü flaskı genellikle küçük hücre hattı popülasyonlarını genişletmek veya yavaş genişleyen bir hücre hattının büyümesini başlatmak için kullanılır. T75 kültür flaskları ise daha hızlı çoğalan hücre hatları için veya bir T25 flaskına sığabileceğinden daha fazla sayıda hücre üretmek için yaygın olarak kullanılır.
Adherent hücreler uzaklaştırılırken, hücreleri plastiğe bağlayan proteinlerin önce parçalanması gerekir. Bu amaçla, sıklıkla tripsin sindirim enzimi kullanılır. Tripsin maruziyet süresinin dikkatle ayarlanması önemlidir, çünkü çok uzun süreli işlem diğer hücre yüzey proteinlerinin hasar görmesine neden olabilir.
Hücre kültürü medyumları tripsin nötralize ediciler içerebilir. Bu nedenle, tripsinizasyon öncesinde hücreleri yıkamak için genellikle fosfat tamponlu salin veya PBS kullanılır.
Bir kalsiyum şelatlayıcısı olan EDTA, bazen tripsinin proteolitik fonksiyonunu artırmak için de kullanılır.
Hücre kolonisinin ekspansiyonu için, yeni pasajlanmış hücreler daha sonra ilgili hücre hattı için uygun koşullar altında, tipik olarak yaklaşık 37 C, %5 CO2 ve %95 nemde bir hücre kültürü inkübatöründe büyütülür.
Başlamadan önce, hücrelerinizin ne sıklıkla izlenmesi gerektiğini anlamak önemlidir; bu durum, hücrelerinizin ne kadar hızlı çoğaldığına bağlı olacaktır.
Besiyeriniz artık sağlıklı bir turuncu renge ulaştığına göre, kültürün bulanık olup olmadığı (bu durum olası bir kontaminasyona işaret eder), hücre kolonilerinin boyutu ve yoğunluğu ile hücrelerin genel kalitesi gibi diğer kültür koşullarını gözlemleyin.
Hücreler yaklaşık %90 konfluense ulaştıysa, doku kültürü besiyerini uzaklaştırın ve hücreleri kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS ile yıkayın.
Şimdi hücrelere tripsin ekleyin ve ardından 37 °C'de inkübe edin. Yaklaşık 5 dakika sonra hücrelerin ayrıldığını onaylayın ve ardından taze doku kültürü besiyeri ekleyerek proteolizi durdurun.
Hücre süspansiyonunu santrifüj için konik bir tüpe aktarın. Ardından, hücreleri çökelttikten sonra, peleti rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın ve hücreleri taze besiyerinde yeniden süspanse edin. Topladığınız hücre sayısını sayın ve ardından hücreleri, hemen veya daha sonraki genişletme için uygun olan yoğunluğa göre ekimleyin.
Hücrelerin nasıl pasajlandığını öğrendiğinize göre, bu yöntemin bazı farklı uygulamalarına bakalım.
Daha önce belirtildiği gibi, insan embriyonik kök hücreleri pasajlanması gereken bir hücre tipidir. Bu hücreler genellikle, kök hücrelerin pluripotent durumlarını korumalarına yardımcı olan faktörleri sağlayan fare embriyonik fibroblastları (MEF'ler) ile ko-kültür edilir.
Besleyici hücreler üzerinde büyütülen kök hücre kolonileri, gelişimin uygun evresine ulaştıklarında "toplanmalıdır". Bu koloniler mikro-pipetle veya cam bir toplama aracıyla nazikçe kazınarak seçilebilir ve ardından genişletme için yeni bir kültüre ekilebilir.
Bazı hücre hatları enzimatik sindirime karşı hassastır veya o kadar sıkı yapışmışlardır ki sadece tripsin uygulamasıyla yeniden süspande edilemezler. Hücreleri kültür plağının tabanından nazikçe uzaklaştırmak için bir hücre kazıyıcı kullanılabilir. Hücreler özellikle yapışkan ise, hücre kabının tabanını medyum veya başka bir uygun çözelti ile durularken serolojik bir pipeti güçlü bir kazıma hareketiyle hareket ettirmeyi deneyin. Hassas hücreler bu mekanik disosiasyon yöntemiyle zarar görebileceği için bu yöntemde dikkatli olun.
Hücre genişletmesini tek katmanlı flasklarda elde edilebileceğinden daha hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçeklendirmek için, hücre kültürlerini tek katmanlı flasklara kıyasla 3-5 kat daha fazla genişletebilen çok katmanlı flasklar kullanılabilir.
JoVE'nin hücre pasajlama konusundaki giriş videosunu izlediniz. Bu videoda hücre hattının ne olduğunu, nasıl alt kültür yapılacağını ve hücre pasajlamanın farklı uygulama alanlarını gözden geçirdik. İzlediğiniz için teşekkürler ve medyanızın taze kalmasını sağlamayı unutmayın!
Hücre hatları, deney analizleri için hücre tiplerinin hızlıca kültüre edilmesi ve çoğaltılmasına olanak tanıdıkları için biyomedikal deneylerde sıklık…
Hücrelerin pasajlanması veya alt kültürlerinin oluşturulması, belirli bir kültürdeki hücrelerin yeni kültürlere bölünmesi veya "ayrılması" ve daha fazla genişlemeyi kolaylaştırmak için taze besiyeri ile beslendiği yaygın bir işlemdir. Kavramın kendisi nispeten basit olsa da, bu videoda hücre hatlarının başarılı bir şekilde sürdürülmesi ve genişletilmesi için gereken bazı önemli adımları ele alacağız.
Toksik metabolitler zamanla hücre kültürü ortamında birikir. Hücre genişletme işlemleri sırasında, hücre sağlığını korumak için ortamın düzenli olarak değiştirilmesi ve hücrelerin aşırı büyümesini önlemek için hücre genişlemesinin izlenmesi özellikle önemlidir.
Genellikle iki ana hücre tipi subkültür yapılır: ölümsüzleştirilmiş hücre hatları ve kök hücre hatları
Ölümsüzleştirilmiş hücre hatları, hücre döngüsü düzenlemelerini etkileyen bir mutasyon geçirmiş ve bu sayede süresiz olarak çoğalabilen çok hücreli organizmalardan türetilen hücrelerdir. Belki de en ünlü ölümsüzleştirilmiş hücre hattı, 1951 yılında Bayan Henrietta Lacks'ten alınan bir biyopside saptanan serviks kanseri lezyonundan türetilen HeLa hücre hattıdır.
Kanser nedeniyle ölümsüzleştirilen hücre hatlarının aksine, kök hücre hatları hem yetişkin hem de embriyonik dokulardan, çeşitli dokulardan kendi kendini yenileyebilen ve multipotent hücrelerin izole edilmesiyle oluşturulur. Uygun koşullar altında, burada gördüğünüz insan embriyonik kök hücreleri gibi bu hücreler kültürde süresiz olarak tutulabilir.
Hücreler ya kandan izole edilen ölümsüzleştirilmiş hücreler gibi süspansiyonda optimal şekilde kültüre edilirler ya da birçok doku kaynaklı hücrede olduğu gibi bir yüzeye yapıştıklarında en iyi şekilde büyürler.
Hücre sağlığını sağlamak için bu yapışkan hücrelerin büyümesi yakından izlenmelidir. Hücre tipine bağlı olarak, çoğu yapışkan hücre %70-90 konfluens düzeyine ulaştığında, yani kültür kabı yüzeyinin %70-90'ını kapladığında pasajlanmalıdır.
Hücre hatlarının orijinal hücre kültürünün birçok özelliğini koruduğunu, ancak her ardışık pasajla birlikte genişletilmiş kültüre özgü özellikler kazanmaya başlayabileceklerini unutmayın. Bu nedenle, tek bir hücre kültürünü pasajlama sayınızı sınırlandırmayı düşünün.
Hücre pasajlama işlemi sırasında, steril tekniklerin yanı sıra uygun reaktiflerin ve ekipmanların kullanılması önemlidir.
Hücre hattınızın optimal büyümesi ve ekspansiyonu için uygun medyumların kullanılması esastır. Her hücre hattı spesifik bir büyüme takviyesi kokteyli gerektirecektir; ancak çoğu hücre hattı en azından şunlarla takviye edilmelidir: Bovine komplemanı inaktive etmek için ısıtılmış olması gereken ve hücreler için hayati büyüme faktörleri sağlayan Fetal Bovine Serum gibi bir serum, kültürde kontaminasyon büyümesini sınırlamaya yardımcı olan penisilin ve streptomisin gibi antibiyotikler ve hücre hatlarının büyüme ve ekspansiyon süresini uzatmaya yardımcı olan fibroblast büyüme faktörü gibi diğer büyüme faktörleri. Takviyeli veya "tam" hücre kültürü medyumlarını kullanmadığınız zamanlarda 4 C'de saklayın.
İlk olarak, doku kültürü medyumunun rengine dikkat edin. Taze hücre kültürü medyumları besin açısından zengindir ve kısmen pH indikatörü olan fenol kırmızı eklenmesi nedeniyle berrak, turuncu bir renkte görünür.
Hücreler medyumdaki besinleri tüketmeye başladığında, hücre kültüründe atıklar ve asit birikmeye başlayarak pH değerini düşürür. Bu nedenle, birçok doku kültürü medyumu, hücreler kültürü asidik hale getirdiğinde medyumun rengini turuncudan sarıya çeviren fenol kırmızı içerir. Medyum bu renge dönmeden önce değiştirin!
Fenol kırmızı medyumun rengini pembemsi bir renge çevirdiğinde, bu durum pH'ın sağlıklı hücre büyümesi için çok bazik hale geldiğini gösterir; bu durumda hem CO2 tankınızı hem de medyumunuzu değiştirme zamanı gelmiş olabilir.
Çoğu adherent hücre hattı, kaplanmamış plastiğe doğal olarak tutunur. Bu nedenle, petri kapları veya 6 kuyucuklu plakalar gibi plastik hücre kültürü plakaları, hücrelerin alt kültürlenmesi için sıklıkla kullanılır.
Plastik hücre kültürü flaskları da kullanılır. Örneğin, T25 hücre kültürü flaskı genellikle küçük hücre hattı popülasyonlarını genişletmek veya yavaş genişleyen bir hücre hattının büyümesini başlatmak için kullanılır. T75 kültür flaskları ise daha hızlı çoğalan hücre hatları için veya bir T25 flaskına sığabileceğinden daha fazla sayıda hücre üretmek için yaygın olarak kullanılır.
Adherent hücreler uzaklaştırılırken, hücreleri plastiğe bağlayan proteinlerin önce parçalanması gerekir. Bu amaçla, sıklıkla tripsin sindirim enzimi kullanılır. Tripsin maruziyet süresinin dikkatle ayarlanması önemlidir, çünkü çok uzun süreli işlem diğer hücre yüzey proteinlerinin hasar görmesine neden olabilir.
Hücre kültürü medyumları tripsin nötralize ediciler içerebilir. Bu nedenle, tripsinizasyon öncesinde hücreleri yıkamak için genellikle fosfat tamponlu salin veya PBS kullanılır.
Bir kalsiyum şelatlayıcısı olan EDTA, bazen tripsinin proteolitik fonksiyonunu artırmak için de kullanılır.
Hücre kolonisinin ekspansiyonu için, yeni pasajlanmış hücreler daha sonra ilgili hücre hattı için uygun koşullar altında, tipik olarak yaklaşık 37 C, %5 CO2 ve %95 nemde bir hücre kültürü inkübatöründe büyütülür.
Başlamadan önce, hücrelerinizin ne sıklıkla izlenmesi gerektiğini anlamak önemlidir; bu durum, hücrelerinizin ne kadar hızlı çoğaldığına bağlı olacaktır.
Besiyeriniz artık sağlıklı bir turuncu renge ulaştığına göre, kültürün bulanık olup olmadığı (bu durum olası bir kontaminasyona işaret eder), hücre kolonilerinin boyutu ve yoğunluğu ile hücrelerin genel kalitesi gibi diğer kültür koşullarını gözlemleyin.
Hücreler yaklaşık %90 konfluense ulaştıysa, doku kültürü besiyerini uzaklaştırın ve hücreleri kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS ile yıkayın.
Şimdi hücrelere tripsin ekleyin ve ardından 37 °C'de inkübe edin. Yaklaşık 5 dakika sonra hücrelerin ayrıldığını onaylayın ve ardından taze doku kültürü besiyeri ekleyerek proteolizi durdurun.
Hücre süspansiyonunu santrifüj için konik bir tüpe aktarın. Ardından, hücreleri çökelttikten sonra, peleti rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın ve hücreleri taze besiyerinde yeniden süspanse edin. Topladığınız hücre sayısını sayın ve ardından hücreleri, hemen veya daha sonraki genişletme için uygun olan yoğunluğa göre ekimleyin.
Hücrelerin nasıl pasajlandığını öğrendiğinize göre, bu yöntemin bazı farklı uygulamalarına bakalım.
Daha önce belirtildiği gibi, insan embriyonik kök hücreleri pasajlanması gereken bir hücre tipidir. Bu hücreler genellikle, kök hücrelerin pluripotent durumlarını korumalarına yardımcı olan faktörleri sağlayan fare embriyonik fibroblastları (MEF'ler) ile ko-kültür edilir.
Besleyici hücreler üzerinde büyütülen kök hücre kolonileri, gelişimin uygun evresine ulaştıklarında "toplanmalıdır". Bu koloniler mikro-pipetle veya cam bir toplama aracıyla nazikçe kazınarak seçilebilir ve ardından genişletme için yeni bir kültüre ekilebilir.
Bazı hücre hatları enzimatik sindirime karşı hassastır veya o kadar sıkı yapışmışlardır ki sadece tripsin uygulamasıyla yeniden süspande edilemezler. Hücreleri kültür plağının tabanından nazikçe uzaklaştırmak için bir hücre kazıyıcı kullanılabilir. Hücreler özellikle yapışkan ise, hücre kabının tabanını medyum veya başka bir uygun çözelti ile durularken serolojik bir pipeti güçlü bir kazıma hareketiyle hareket ettirmeyi deneyin. Hassas hücreler bu mekanik disosiasyon yöntemiyle zarar görebileceği için bu yöntemde dikkatli olun.
Hücre genişletmesini tek katmanlı flasklarda elde edilebileceğinden daha hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçeklendirmek için, hücre kültürlerini tek katmanlı flasklara kıyasla 3-5 kat daha fazla genişletebilen çok katmanlı flasklar kullanılabilir.
JoVE'nin hücre pasajlama konusundaki giriş videosunu izlediniz. Bu videoda hücre hattının ne olduğunu, nasıl alt kültür yapılacağını ve hücre pasajlamanın farklı uygulama alanlarını gözden geçirdik. İzlediğiniz için teşekkürler ve medyanızın taze kalmasını sağlamayı unutmayın!
Hücrelerin pasajlanması veya alt kültürlerinin oluşturulması, belirli bir kültürdeki hücrelerin yeni kültürlere bölünmesi veya "ayrılması" ve daha fazla genişlemeyi kolaylaştırmak için taze besiyeri ile beslendiği yaygın bir işlemdir. Kavramın kendisi nispeten basit olsa da, bu videoda hücre hatlarının başarılı bir şekilde sürdürülmesi ve genişletilmesi için gereken bazı önemli adımları ele alacağız.
Toksik metabolitler zamanla hücre kültürü ortamında birikir. Hücre genişletme işlemleri sırasında, hücre sağlığını korumak için ortamın düzenli olarak değiştirilmesi ve hücrelerin aşırı büyümesini önlemek için hücre genişlemesinin izlenmesi özellikle önemlidir.
Genellikle iki ana hücre tipi subkültür yapılır: ölümsüzleştirilmiş hücre hatları ve kök hücre hatları
Ölümsüzleştirilmiş hücre hatları, hücre döngüsü düzenlemelerini etkileyen bir mutasyon geçirmiş ve bu sayede süresiz olarak çoğalabilen çok hücreli organizmalardan türetilen hücrelerdir. Belki de en ünlü ölümsüzleştirilmiş hücre hattı, 1951 yılında Bayan Henrietta Lacks'ten alınan bir biyopside saptanan serviks kanseri lezyonundan türetilen HeLa hücre hattıdır.
Kanser nedeniyle ölümsüzleştirilen hücre hatlarının aksine, kök hücre hatları hem yetişkin hem de embriyonik dokulardan, çeşitli dokulardan kendi kendini yenileyebilen ve multipotent hücrelerin izole edilmesiyle oluşturulur. Uygun koşullar altında, burada gördüğünüz insan embriyonik kök hücreleri gibi bu hücreler kültürde süresiz olarak tutulabilir.
Hücreler ya kandan izole edilen ölümsüzleştirilmiş hücreler gibi süspansiyonda optimal şekilde kültüre edilirler ya da birçok doku kaynaklı hücrede olduğu gibi bir yüzeye yapıştıklarında en iyi şekilde büyürler.
Hücre sağlığını sağlamak için bu yapışkan hücrelerin büyümesi yakından izlenmelidir. Hücre tipine bağlı olarak, çoğu yapışkan hücre %70-90 konfluens düzeyine ulaştığında, yani kültür kabı yüzeyinin %70-90'ını kapladığında pasajlanmalıdır.
Hücre hatlarının orijinal hücre kültürünün birçok özelliğini koruduğunu, ancak her ardışık pasajla birlikte genişletilmiş kültüre özgü özellikler kazanmaya başlayabileceklerini unutmayın. Bu nedenle, tek bir hücre kültürünü pasajlama sayınızı sınırlandırmayı düşünün.
Hücre pasajlama işlemi sırasında, steril tekniklerin yanı sıra uygun reaktiflerin ve ekipmanların kullanılması önemlidir.
Hücre hattınızın optimal büyümesi ve ekspansiyonu için uygun medyumların kullanılması esastır. Her hücre hattı spesifik bir büyüme takviyesi kokteyli gerektirecektir; ancak çoğu hücre hattı en azından şunlarla takviye edilmelidir: Bovine komplemanı inaktive etmek için ısıtılmış olması gereken ve hücreler için hayati büyüme faktörleri sağlayan Fetal Bovine Serum gibi bir serum, kültürde kontaminasyon büyümesini sınırlamaya yardımcı olan penisilin ve streptomisin gibi antibiyotikler ve hücre hatlarının büyüme ve ekspansiyon süresini uzatmaya yardımcı olan fibroblast büyüme faktörü gibi diğer büyüme faktörleri. Takviyeli veya "tam" hücre kültürü medyumlarını kullanmadığınız zamanlarda 4 C'de saklayın.
İlk olarak, doku kültürü medyumunun rengine dikkat edin. Taze hücre kültürü medyumları besin açısından zengindir ve kısmen pH indikatörü olan fenol kırmızı eklenmesi nedeniyle berrak, turuncu bir renkte görünür.
Hücreler medyumdaki besinleri tüketmeye başladığında, hücre kültüründe atıklar ve asit birikmeye başlayarak pH değerini düşürür. Bu nedenle, birçok doku kültürü medyumu, hücreler kültürü asidik hale getirdiğinde medyumun rengini turuncudan sarıya çeviren fenol kırmızı içerir. Medyum bu renge dönmeden önce değiştirin!
Fenol kırmızı medyumun rengini pembemsi bir renge çevirdiğinde, bu durum pH'ın sağlıklı hücre büyümesi için çok bazik hale geldiğini gösterir; bu durumda hem CO2 tankınızı hem de medyumunuzu değiştirme zamanı gelmiş olabilir.
Çoğu adherent hücre hattı, kaplanmamış plastiğe doğal olarak tutunur. Bu nedenle, petri kapları veya 6 kuyucuklu plakalar gibi plastik hücre kültürü plakaları, hücrelerin alt kültürlenmesi için sıklıkla kullanılır.
Plastik hücre kültürü flaskları da kullanılır. Örneğin, T25 hücre kültürü flaskı genellikle küçük hücre hattı popülasyonlarını genişletmek veya yavaş genişleyen bir hücre hattının büyümesini başlatmak için kullanılır. T75 kültür flaskları ise daha hızlı çoğalan hücre hatları için veya bir T25 flaskına sığabileceğinden daha fazla sayıda hücre üretmek için yaygın olarak kullanılır.
Adherent hücreler uzaklaştırılırken, hücreleri plastiğe bağlayan proteinlerin önce parçalanması gerekir. Bu amaçla, sıklıkla tripsin sindirim enzimi kullanılır. Tripsin maruziyet süresinin dikkatle ayarlanması önemlidir, çünkü çok uzun süreli işlem diğer hücre yüzey proteinlerinin hasar görmesine neden olabilir.
Hücre kültürü medyumları tripsin nötralize ediciler içerebilir. Bu nedenle, tripsinizasyon öncesinde hücreleri yıkamak için genellikle fosfat tamponlu salin veya PBS kullanılır.
Bir kalsiyum şelatlayıcısı olan EDTA, bazen tripsinin proteolitik fonksiyonunu artırmak için de kullanılır.
Hücre kolonisinin ekspansiyonu için, yeni pasajlanmış hücreler daha sonra ilgili hücre hattı için uygun koşullar altında, tipik olarak yaklaşık 37 C, %5 CO2 ve %95 nemde bir hücre kültürü inkübatöründe büyütülür.
Başlamadan önce, hücrelerinizin ne sıklıkla izlenmesi gerektiğini anlamak önemlidir; bu durum, hücrelerinizin ne kadar hızlı çoğaldığına bağlı olacaktır.
Besiyeriniz artık sağlıklı bir turuncu renge ulaştığına göre, kültürün bulanık olup olmadığı (bu durum olası bir kontaminasyona işaret eder), hücre kolonilerinin boyutu ve yoğunluğu ile hücrelerin genel kalitesi gibi diğer kültür koşullarını gözlemleyin.
Hücreler yaklaşık %90 konfluense ulaştıysa, doku kültürü besiyerini uzaklaştırın ve hücreleri kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS ile yıkayın.
Şimdi hücrelere tripsin ekleyin ve ardından 37 °C'de inkübe edin. Yaklaşık 5 dakika sonra hücrelerin ayrıldığını onaylayın ve ardından taze doku kültürü besiyeri ekleyerek proteolizi durdurun.
Hücre süspansiyonunu santrifüj için konik bir tüpe aktarın. Ardından, hücreleri çökelttikten sonra, peleti rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın ve hücreleri taze besiyerinde yeniden süspanse edin. Topladığınız hücre sayısını sayın ve ardından hücreleri, hemen veya daha sonraki genişletme için uygun olan yoğunluğa göre ekimleyin.
Hücrelerin nasıl pasajlandığını öğrendiğinize göre, bu yöntemin bazı farklı uygulamalarına bakalım.
Daha önce belirtildiği gibi, insan embriyonik kök hücreleri pasajlanması gereken bir hücre tipidir. Bu hücreler genellikle, kök hücrelerin pluripotent durumlarını korumalarına yardımcı olan faktörleri sağlayan fare embriyonik fibroblastları (MEF'ler) ile ko-kültür edilir.
Besleyici hücreler üzerinde büyütülen kök hücre kolonileri, gelişimin uygun evresine ulaştıklarında "toplanmalıdır". Bu koloniler mikro-pipetle veya cam bir toplama aracıyla nazikçe kazınarak seçilebilir ve ardından genişletme için yeni bir kültüre ekilebilir.
Bazı hücre hatları enzimatik sindirime karşı hassastır veya o kadar sıkı yapışmışlardır ki sadece tripsin uygulamasıyla yeniden süspande edilemezler. Hücreleri kültür plağının tabanından nazikçe uzaklaştırmak için bir hücre kazıyıcı kullanılabilir. Hücreler özellikle yapışkan ise, hücre kabının tabanını medyum veya başka bir uygun çözelti ile durularken serolojik bir pipeti güçlü bir kazıma hareketiyle hareket ettirmeyi deneyin. Hassas hücreler bu mekanik disosiasyon yöntemiyle zarar görebileceği için bu yöntemde dikkatli olun.
Hücre genişletmesini tek katmanlı flasklarda elde edilebileceğinden daha hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçeklendirmek için, hücre kültürlerini tek katmanlı flasklara kıyasla 3-5 kat daha fazla genişletebilen çok katmanlı flasklar kullanılabilir.
JoVE'nin hücre pasajlama konusundaki giriş videosunu izlediniz. Bu videoda hücre hattının ne olduğunu, nasıl alt kültür yapılacağını ve hücre pasajlamanın farklı uygulama alanlarını gözden geçirdik. İzlediğiniz için teşekkürler ve medyanızın taze kalmasını sağlamayı unutmayın!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the difference between immortalized cell lines and stem cell lines?
Immortalized cell lines derive from multicellular organisms with mutations affecting cell cycle regulation, allowing indefinite proliferation. Stem cell lines are generated by isolating self-renewing, multipotent cells from adult or embryonic tissues. Both can be maintained indefinitely in culture under appropriate conditions, but stem cells retain pluripotency while immortalized cells do not.
Q2: Why is it important to change cell culture media regularly?
Toxic metabolites accumulate in cell culture media over time, lowering pH and reducing nutrient availability. Fresh media maintains cell health and supports continued expansion. Media color indicators like phenol red signal when changes are needed—orange indicates fresh media, yellow indicates acidic conditions requiring immediate media change, and pink suggests pH is too basic.
Q3: What does 90% confluency mean and why does it matter for cell passaging?
Confluency refers to the percentage of culture container surface covered by cells. At 90% confluency, adherent cells cover most of the container bottom and must be passaged to prevent overgrowth and maintain cell health. Monitoring confluency ensures cells are split at the optimal time for expansion and prevents toxic metabolite accumulation.
Q4: What are the essential components of complete cell culture media?
Complete media requires serum such as heat-treated Fetal Bovine Serum for growth factors, antibiotics like penicillin and streptomycin to prevent contamination, and additional growth factors such as fibroblast growth factor to prolong expansion. Each cell line requires a specific growth supplement cocktail tailored to its needs. Store complete media at 4°C when not in use.
Q5: How is trypsin used to remove adherent cells from culture plates?
Trypsin is a digestive enzyme that cleaves proteins binding cells to plastic surfaces. Cells are first washed with calcium- and magnesium-free phosphate buffered saline, then trypsin is added and incubated at 37°C for approximately 5 minutes. Careful timing is critical to avoid damaging cell surface proteins. Fresh media is added to stop proteolysis before transferring cells to a conical tube for counting using hemacytometer methods and applications.
Q6: What are alternative methods for removing cells that are too adherent for standard trypsin treatment?
For cells sensitive to enzymatic digestion or extremely adherent to plates, a cell scraper can gently remove cells from the culture container bottom. Alternatively, a serological pipette can be used in a firm scraping motion while rinsing with media. Mechanical dissociation requires care, as delicate cells can be damaged by these methods.
Q7: How can cell cultures be expanded more rapidly than single-layer flasks allow?
Multilayer flasks expand cell cultures 3-5 fold compared to single-layer flasks, enabling faster and more reproducible scale-up of cell expansion. These specialized culture vessels provide increased surface area for cell growth, making them ideal for generating large numbers of cells efficiently while maintaining appropriate culture conditions.
Bu videodaki bölümler
0:00
Overview
0:40
Basic Principles of Subculturing Cells
2:59
Common Equipment/Reagents for Passaging Cells
6:36
How to Passage Cells
8:03
Applications
9:36
Summary