Bakteriyel Transformasyon: Elektroporasyon
Bakteriyel transformasyon, bakterilerin yabancı DNA'yı bünyelerine alıp ardından çoğalttıkları veya klonladıkları, doğal olarak gerçekleşen bir süreçtir. Laboratuvar ortamında bu işlem, bakteriyel hücre membranında plazmid DNA'nın geçebileceği gözenekler oluşturmak için yüksek voltajlı elektrik alanı darbeleri kullanılarak yapay olarak tetiklenebilir. Elektroporasyon bu yöntemi ifade eder ve aşağıdaki video, bu yöntemin prensiplerini, adım adım prosedürünü ve uygulamalarını gösterecektir.
Bakterilerin elektroporasyonunu konuşmadan önce, bu deneylerde kullanılan DNA tipini anlamak önemlidir: plazmit. Plazmit, spesifik DNA dizinizin taşıyıcısı olan bir vektör görevi gören, küçük, halkasal ve ekrakromozomal bir DNA parçasıdır.
Bu dizinin, denizanasındaki bir floresan protein geni veya bitkilerden gelen bir enzim olması fark etmeksizin, çoklu klonlama bölgesi veya MCS olarak adlandırılan bir bölge aracılığıyla plazmite yerleştirilir. Bu bölge, restriksiyon endonükleazları veya restriksiyon enzimleri tarafından kesilen spesifik diziler içerir. Uçların, plazmitin yeni kesilmiş uçlarıyla tamamlayıcı olması için, hedef dizinizi kesmek amacıyla aynı restriksiyon enzimleri kullanılabilir.
Plazmitler ayrıca, replikasyonun gerçekleşeceği noktayı belirten ve ORI olarak kısaltılan bir replikasyon orijini içerir. Transformasyon söz konusu olduğunda, antibiyotik direnç geni hayati öneme sahiptir. Adından da anlaşılacağı gibi bu gen, bakterilerin antibiyotiği nötralize eden bir enzim üretmesini sağlayarak antibiyotik içeren besiyerlerinde hayatta kalmalarına imkan tanır.
Elektroporasyon, elektroporatör adı verilen özel bir cihaz kullanılarak gerçekleştirilir. Hücreler genellikle, yerleştirildiklerinde makine ile elektriksel temas kuran her iki yanında elektrotlar bulunan bir elektroporasyon küvetine yerleştirilir.
DNA ile karıştırılmış bakteri hücreleri elektroporasyon küvetine yüklenir ve birkaç milisaniye boyunca santimetre başına 1000 ila 10.000 volt mertebesinde bir elektrik alanı uygulanır. Bu işlem, membran üzerindeki voltajın 0,5-1 volt değerine ulaşmasına neden olur; bunun, hücre membranını oluşturan fosfolipid çift tabakasının gözenekler oluşacak şekilde yeniden düzenlenmesine yol açtığına inanılmaktadır. Bu durumda plazmid DNA membran boyunca geçer ve darbeleme işlemi tamamlandığında çift tabaka kendini onarır.
Plazmidi alan bakteriler, daha sonra antibiyotik içeren agar plaklarında büyütülebilir.
Plazmidleri ve elektroporasyon mekanizmasını öğrendiğimize göre, işlemin nasıl yürütüldüğüne bir bakalım.
DNA'yı kolayca alabilen hücrelere kompetan hücreler denir. Moleküler biyoloji araştırmalarında transformasyon uygulanan en yaygın kompetan bakteri türü, alt bağırsaklarınızda yaşayan prokaryotik bakteriler olan E. coli'dir. Elektroporasyon için hazırlanan E. coli bakterilerine elektrokometan hücreler denir.
Bakterilerle çalışırken, çalışma alanının mümkün olduğunca temiz olduğundan emin olun.
Bakterilerle çalışmak aynı zamanda aseptik tekniklerin uygulanmasını gerektirir. Bu genellikle, aletleri sterilize etmek ve havadaki kontaminanları çalışma alanından uzak tutan bir konveksiyon akımı oluşturmak için bir Bunsen bek kullanımını içerir.
Elektroporasyondan hemen önce, besiyerini oda sıcaklığına getirin, antibiyotik içeren agar plaklarını 37°C'ye ısıtın ve elektroporasyon küvetlerini buz üzerinde soğutun.
Ardından, yıkanmış elektrokometan hücreleri buz üzerinde çözdürün.
Bakteriyel hücrelere, tuz içermeyen 1ng/μL konsantrasyonunda 1-5uL soğuk plazmid ekleyin, nazikçe karıştırın ve karışımı soğuk küvete aktarın. Hava kabarcığı kalmadığından emin olun.
Elektroporatörün voltaj ve alan gücünü hücreleriniz için uygun ayarlara getirin. Burada, bir elektroporatörün 1700 volt değerine ayarlandığını ve 17kV/cm alan gücü sağladığını görüyorsunuz.
Küvetin dışını kurulayın ve elektroporatöre yerleştirin. Bir bip sesi duyana kadar hücrelere puls uygulayın.
Başarısız puls işlemi, görünür bir kıvılcım ve duyulabilir bir patlama şeklinde gözlemlenebilen bir elektrik boşalmasına neden olur. Ark yapma olarak adlandırılan bu boşalma, kompetan hücrelerinizde veya DNA'nızda çok fazla tuz bulunmasının bir sonucu olabilir.
Transformasyonunuzun başarısı, puls uygulandıktan sonra voltajın sönümlenmesi için geçen süre olan zaman sabitine bakılarak tahmin edilebilir. Tuz mevcut olduğunda ve elektroporasyon solüsyonu çok iletken olduğunda, sönümlenme hızla gerçekleşir, bu da boşalmaya neden olur ve böylece hücrelerinizin çoğunu öldürür. Bakteriler için ideal zaman sabitleri 5-10 milisaniye arasındadır.
Pulstan hemen sonra küveti çıkarın ve doğrudan hücrelerin üzerine 1 ml besiyeri ekleyin. Hücre içeren bu besiyeri bir tüpe yerleştirilir ve hücrelerin toparlanması için 37°C'de 1 saat boyunca çalkalamalı inkübasyona bırakılır.
Ardından, aseptik teknik kullanarak hücreden 20-200uL'yi antibiyotik içeren bir agar plaka üzerine ekleyin. Kondansasyonun hücrelerin üzerine düşmemesi için agar üstte kalacak şekilde plakaları ters çevirin ve 37°C'de gece boyunca inkübe edin.
Plazmid ile transforme olan bakteriler koloni oluşturmalıdır. Kolonileri sayın ve başarılı transformant sayısının plakaya ekilen toplam DNA miktarına bölünmesiyle elde edilen transformasyon verimliliğini hesaplayın.
Bakterileriniz için besin sağlayan agar ve besiyerleri önceden hazırlanmış ve otoklav ile sterilize edilmiş olmalıdır. Sıvı besiyerlerinin kullanım öncesinde oda sıcaklığına soğumasını bekleyin ve agarı, antibiyotiğin eklenebileceği ve plakların dökülebileceği sıcaklık olan 50-55˚C'ye kadar soğutun. Ardından, katılaşmaları için plakların oda sıcaklığına soğumasına izin verin.
Transformasyonda kullanılan bakteriler dondurucuda saklandığından, öncelikle buz üzerinde çözdürülmeli, antibiyotiksiz bir agar plağına yayılmalı ve ardından 37˚C'de gece boyunca büyütülmelidir.
Aseptik teknik kullanarak agar plağından bir bakteri kolonisi seçin ve bunu daha büyük 500mL'lik bir kültürde, çalkalayıcı inkübatörde 37°C'de gece boyunca büyütün.
Hücreler büyürken, yaklaşık bir litre deiyonize su hazırlayın ve hacimce %10 gliserol ve su çözeltisi oluşturun. Çözeltileri otoklavlayın ve 4˚C'de soğumaya bırakın.
Absorbans ölçümleri, bakterilerin DNA'yı kolayca alabilecekleri büyüme evresinin orta logaritmik fazında olup olmadıklarını belirlemek için kullanılır. Hücreler bu evreye ulaştığında, onları buz üzerine yerleştirin ve prosedür boyunca orada tutun.
Ardından, hücreleri iki büyük santrifüj tüpüne ayırarak 4°C'de santrifüjleyip yıkayın, süpernatantı dökün ve soğuk 100mL steril deiyonize su içinde yeniden süspanse edin. Bu adımı en az bir kez daha tekrarlayın. Bu özel adımın amacı, elektroporasyon tekniğini güçlü şekilde etkileyecek olan tuzu uzaklaştırmaktır.
Suda %10 gliserol içeren 50 ml çözelti ile iki ek yıkama daha gerçekleştirin ve son olarak bakterileri aynı çözelti içinde yeniden süspanse edin.
Birden fazla Eppendorf tüpüne 50μL hücre ekleyin. Bu hücreler artık elektroporasyonda kullanım için hazırdır ve 4˚C'de tutulmalıdır. Alternatif olarak, şok dondurularak -80˚C'de saklanabilirler.
Göreceğiniz üzere, elektroporasyonun birçok uygulama alanı vardır.
Elektroporasyona bir alternatif, DNA'yı hücrelere aktarmak için bakterilerin hem kalsiyum klorüre hem de ısıya maruz bırakılmasına dayanan ısı şoku transformasyonudur.
Genel olarak ısı şoku, bakteriler için elektroporasyondan daha yumuşak bir yöntemdir ve düşük tuz konsantrasyonu gerektirmez. Hedef geninizin plazmide yerleştirilmesini içeren ligasyon reaksiyonları, doğrudan ısı şoku transformasyonunda kullanılabilir. Isı şoku transformasyonu, elektroporasyondan daha ucuzdur ve pahalı ekipmanlara veya küvetlere ihtiyaç duymaz. Öte yandan, ısı şoku, elektroporasyona göre daha düşük transformasyon verimliliğine yol açar ve daha uzun sürer. Ayrıca ısı şoku; bakteri, maya ve bitki protoplastları ile sınırlıyken, elektroporasyon memeli hücrelere de uygulanabilir.
Burada, fare embriyonik fibroblastlarının bir elektroporasyon küvetine yüklendiğini görüyorsunuz. Elektroporasyon tamamlandığında, transformasyon verimliliği, hücrelerin plazmit tarafından kodlanan yeşil floresan proteini üretme düzeyi gözlemlenerek belirlenebilir. Memeli hücrelerin transformasyonuna transfeksiyon adı verilir; bu işlem genellikle bakteriyel hücrelere göre daha düşük alan şiddetleri ve daha yüksek zaman sabitleri gerektirir.
Elektroporasyon, burada gördüğünüz gelişmekte olan civciv embriyosu gibi bütün hayvanlarda da gerçekleştirilebilir. Plazmit DNA civcivin beynine enjekte edilir ve ardından beyin dokusuna bir elektrik alanı uygulamak için bir elektroporasyon probu kullanılır. Bir veya iki gün sonra, plazmit tarafından kodlanan yeşil ve kırmızı floresan proteinler nöronlar tarafından sentezlenir ve bilim insanları gelişmekte olan civciv beynindeki yapısal değişiklikleri gözlemleyebilir.
Elektroporasyon yoluyla bakteriyel transformasyona giriş JoVE videosunu izlediniz. Bu video, en yaygın transformasyon yapılan DNA tipi olarak plazmidi tanıttı, elektroporasyonun temelinde yattığı düşünülen biyofiziksel mekanizmayı tartıştı, elektroporasyon gerçekleştirme için genel bir prosedürü gösterdi ve elektroporasyonun memeli sistemlerinde nasıl kullanılabileceğini açıkladı. İzlediğiniz için teşekkürler!
“Transformasyon” terimi, hücrenin dış DNA'yı bünyesine almasını ifade eder. Doğada transformasyon, belirli bakteri türlerinde meydana gelebilir. Ancak…
Bakteriyel transformasyon, bakterilerin yabancı DNA'yı bünyelerine alıp ardından çoğalttıkları veya klonladıkları, doğal olarak gerçekleşen bir süreçtir. Laboratuvar ortamında bu işlem, bakteriyel hücre membranında plazmid DNA'nın geçebileceği gözenekler oluşturmak için yüksek voltajlı elektrik alanı darbeleri kullanılarak yapay olarak tetiklenebilir. Elektroporasyon bu yöntemi ifade eder ve aşağıdaki video, bu yöntemin prensiplerini, adım adım prosedürünü ve uygulamalarını gösterecektir.
Bakterilerin elektroporasyonunu konuşmadan önce, bu deneylerde kullanılan DNA tipini anlamak önemlidir: plazmit. Plazmit, spesifik DNA dizinizin taşıyıcısı olan bir vektör görevi gören, küçük, halkasal ve ekrakromozomal bir DNA parçasıdır.
Bu dizinin, denizanasındaki bir floresan protein geni veya bitkilerden gelen bir enzim olması fark etmeksizin, çoklu klonlama bölgesi veya MCS olarak adlandırılan bir bölge aracılığıyla plazmite yerleştirilir. Bu bölge, restriksiyon endonükleazları veya restriksiyon enzimleri tarafından kesilen spesifik diziler içerir. Uçların, plazmitin yeni kesilmiş uçlarıyla tamamlayıcı olması için, hedef dizinizi kesmek amacıyla aynı restriksiyon enzimleri kullanılabilir.
Plazmitler ayrıca, replikasyonun gerçekleşeceği noktayı belirten ve ORI olarak kısaltılan bir replikasyon orijini içerir. Transformasyon söz konusu olduğunda, antibiyotik direnç geni hayati öneme sahiptir. Adından da anlaşılacağı gibi bu gen, bakterilerin antibiyotiği nötralize eden bir enzim üretmesini sağlayarak antibiyotik içeren besiyerlerinde hayatta kalmalarına imkan tanır.
Elektroporasyon, elektroporatör adı verilen özel bir cihaz kullanılarak gerçekleştirilir. Hücreler genellikle, yerleştirildiklerinde makine ile elektriksel temas kuran her iki yanında elektrotlar bulunan bir elektroporasyon küvetine yerleştirilir.
DNA ile karıştırılmış bakteri hücreleri elektroporasyon küvetine yüklenir ve birkaç milisaniye boyunca santimetre başına 1000 ila 10.000 volt mertebesinde bir elektrik alanı uygulanır. Bu işlem, membran üzerindeki voltajın 0,5-1 volt değerine ulaşmasına neden olur; bunun, hücre membranını oluşturan fosfolipid çift tabakasının gözenekler oluşacak şekilde yeniden düzenlenmesine yol açtığına inanılmaktadır. Bu durumda plazmid DNA membran boyunca geçer ve darbeleme işlemi tamamlandığında çift tabaka kendini onarır.
Plazmidi alan bakteriler, daha sonra antibiyotik içeren agar plaklarında büyütülebilir.
Plazmidleri ve elektroporasyon mekanizmasını öğrendiğimize göre, işlemin nasıl yürütüldüğüne bir bakalım.
DNA'yı kolayca alabilen hücrelere kompetan hücreler denir. Moleküler biyoloji araştırmalarında transformasyon uygulanan en yaygın kompetan bakteri türü, alt bağırsaklarınızda yaşayan prokaryotik bakteriler olan E. coli'dir. Elektroporasyon için hazırlanan E. coli bakterilerine elektrokometan hücreler denir.
Bakterilerle çalışırken, çalışma alanının mümkün olduğunca temiz olduğundan emin olun.
Bakterilerle çalışmak aynı zamanda aseptik tekniklerin uygulanmasını gerektirir. Bu genellikle, aletleri sterilize etmek ve havadaki kontaminanları çalışma alanından uzak tutan bir konveksiyon akımı oluşturmak için bir Bunsen bek kullanımını içerir.
Elektroporasyondan hemen önce, besiyerini oda sıcaklığına getirin, antibiyotik içeren agar plaklarını 37°C'ye ısıtın ve elektroporasyon küvetlerini buz üzerinde soğutun.
Ardından, yıkanmış elektrokometan hücreleri buz üzerinde çözdürün.
Bakteriyel hücrelere, tuz içermeyen 1ng/μL konsantrasyonunda 1-5uL soğuk plazmid ekleyin, nazikçe karıştırın ve karışımı soğuk küvete aktarın. Hava kabarcığı kalmadığından emin olun.
Elektroporatörün voltaj ve alan gücünü hücreleriniz için uygun ayarlara getirin. Burada, bir elektroporatörün 1700 volt değerine ayarlandığını ve 17kV/cm alan gücü sağladığını görüyorsunuz.
Küvetin dışını kurulayın ve elektroporatöre yerleştirin. Bir bip sesi duyana kadar hücrelere puls uygulayın.
Başarısız puls işlemi, görünür bir kıvılcım ve duyulabilir bir patlama şeklinde gözlemlenebilen bir elektrik boşalmasına neden olur. Ark yapma olarak adlandırılan bu boşalma, kompetan hücrelerinizde veya DNA'nızda çok fazla tuz bulunmasının bir sonucu olabilir.
Transformasyonunuzun başarısı, puls uygulandıktan sonra voltajın sönümlenmesi için geçen süre olan zaman sabitine bakılarak tahmin edilebilir. Tuz mevcut olduğunda ve elektroporasyon solüsyonu çok iletken olduğunda, sönümlenme hızla gerçekleşir, bu da boşalmaya neden olur ve böylece hücrelerinizin çoğunu öldürür. Bakteriler için ideal zaman sabitleri 5-10 milisaniye arasındadır.
Pulstan hemen sonra küveti çıkarın ve doğrudan hücrelerin üzerine 1 ml besiyeri ekleyin. Hücre içeren bu besiyeri bir tüpe yerleştirilir ve hücrelerin toparlanması için 37°C'de 1 saat boyunca çalkalamalı inkübasyona bırakılır.
Ardından, aseptik teknik kullanarak hücreden 20-200uL'yi antibiyotik içeren bir agar plaka üzerine ekleyin. Kondansasyonun hücrelerin üzerine düşmemesi için agar üstte kalacak şekilde plakaları ters çevirin ve 37°C'de gece boyunca inkübe edin.
Plazmid ile transforme olan bakteriler koloni oluşturmalıdır. Kolonileri sayın ve başarılı transformant sayısının plakaya ekilen toplam DNA miktarına bölünmesiyle elde edilen transformasyon verimliliğini hesaplayın.
Bakterileriniz için besin sağlayan agar ve besiyerleri önceden hazırlanmış ve otoklav ile sterilize edilmiş olmalıdır. Sıvı besiyerlerinin kullanım öncesinde oda sıcaklığına soğumasını bekleyin ve agarı, antibiyotiğin eklenebileceği ve plakların dökülebileceği sıcaklık olan 50-55˚C'ye kadar soğutun. Ardından, katılaşmaları için plakların oda sıcaklığına soğumasına izin verin.
Transformasyonda kullanılan bakteriler dondurucuda saklandığından, öncelikle buz üzerinde çözdürülmeli, antibiyotiksiz bir agar plağına yayılmalı ve ardından 37˚C'de gece boyunca büyütülmelidir.
Aseptik teknik kullanarak agar plağından bir bakteri kolonisi seçin ve bunu daha büyük 500mL'lik bir kültürde, çalkalayıcı inkübatörde 37°C'de gece boyunca büyütün.
Hücreler büyürken, yaklaşık bir litre deiyonize su hazırlayın ve hacimce %10 gliserol ve su çözeltisi oluşturun. Çözeltileri otoklavlayın ve 4˚C'de soğumaya bırakın.
Absorbans ölçümleri, bakterilerin DNA'yı kolayca alabilecekleri büyüme evresinin orta logaritmik fazında olup olmadıklarını belirlemek için kullanılır. Hücreler bu evreye ulaştığında, onları buz üzerine yerleştirin ve prosedür boyunca orada tutun.
Ardından, hücreleri iki büyük santrifüj tüpüne ayırarak 4°C'de santrifüjleyip yıkayın, süpernatantı dökün ve soğuk 100mL steril deiyonize su içinde yeniden süspanse edin. Bu adımı en az bir kez daha tekrarlayın. Bu özel adımın amacı, elektroporasyon tekniğini güçlü şekilde etkileyecek olan tuzu uzaklaştırmaktır.
Suda %10 gliserol içeren 50 ml çözelti ile iki ek yıkama daha gerçekleştirin ve son olarak bakterileri aynı çözelti içinde yeniden süspanse edin.
Birden fazla Eppendorf tüpüne 50μL hücre ekleyin. Bu hücreler artık elektroporasyonda kullanım için hazırdır ve 4˚C'de tutulmalıdır. Alternatif olarak, şok dondurularak -80˚C'de saklanabilirler.
Göreceğiniz üzere, elektroporasyonun birçok uygulama alanı vardır.
Elektroporasyona bir alternatif, DNA'yı hücrelere aktarmak için bakterilerin hem kalsiyum klorüre hem de ısıya maruz bırakılmasına dayanan ısı şoku transformasyonudur.
Genel olarak ısı şoku, bakteriler için elektroporasyondan daha yumuşak bir yöntemdir ve düşük tuz konsantrasyonu gerektirmez. Hedef geninizin plazmide yerleştirilmesini içeren ligasyon reaksiyonları, doğrudan ısı şoku transformasyonunda kullanılabilir. Isı şoku transformasyonu, elektroporasyondan daha ucuzdur ve pahalı ekipmanlara veya küvetlere ihtiyaç duymaz. Öte yandan, ısı şoku, elektroporasyona göre daha düşük transformasyon verimliliğine yol açar ve daha uzun sürer. Ayrıca ısı şoku; bakteri, maya ve bitki protoplastları ile sınırlıyken, elektroporasyon memeli hücrelere de uygulanabilir.
Burada, fare embriyonik fibroblastlarının bir elektroporasyon küvetine yüklendiğini görüyorsunuz. Elektroporasyon tamamlandığında, transformasyon verimliliği, hücrelerin plazmit tarafından kodlanan yeşil floresan proteini üretme düzeyi gözlemlenerek belirlenebilir. Memeli hücrelerin transformasyonuna transfeksiyon adı verilir; bu işlem genellikle bakteriyel hücrelere göre daha düşük alan şiddetleri ve daha yüksek zaman sabitleri gerektirir.
Elektroporasyon, burada gördüğünüz gelişmekte olan civciv embriyosu gibi bütün hayvanlarda da gerçekleştirilebilir. Plazmit DNA civcivin beynine enjekte edilir ve ardından beyin dokusuna bir elektrik alanı uygulamak için bir elektroporasyon probu kullanılır. Bir veya iki gün sonra, plazmit tarafından kodlanan yeşil ve kırmızı floresan proteinler nöronlar tarafından sentezlenir ve bilim insanları gelişmekte olan civciv beynindeki yapısal değişiklikleri gözlemleyebilir.
Elektroporasyon yoluyla bakteriyel transformasyona giriş JoVE videosunu izlediniz. Bu video, en yaygın transformasyon yapılan DNA tipi olarak plazmidi tanıttı, elektroporasyonun temelinde yattığı düşünülen biyofiziksel mekanizmayı tartıştı, elektroporasyon gerçekleştirme için genel bir prosedürü gösterdi ve elektroporasyonun memeli sistemlerinde nasıl kullanılabileceğini açıkladı. İzlediğiniz için teşekkürler!
Bakteriyel transformasyon, bakterilerin yabancı DNA'yı bünyelerine alıp ardından çoğalttıkları veya klonladıkları, doğal olarak gerçekleşen bir süreçtir. Laboratuvar ortamında bu işlem, bakteriyel hücre membranında plazmid DNA'nın geçebileceği gözenekler oluşturmak için yüksek voltajlı elektrik alanı darbeleri kullanılarak yapay olarak tetiklenebilir. Elektroporasyon bu yöntemi ifade eder ve aşağıdaki video, bu yöntemin prensiplerini, adım adım prosedürünü ve uygulamalarını gösterecektir.
Bakterilerin elektroporasyonunu konuşmadan önce, bu deneylerde kullanılan DNA tipini anlamak önemlidir: plazmit. Plazmit, spesifik DNA dizinizin taşıyıcısı olan bir vektör görevi gören, küçük, halkasal ve ekrakromozomal bir DNA parçasıdır.
Bu dizinin, denizanasındaki bir floresan protein geni veya bitkilerden gelen bir enzim olması fark etmeksizin, çoklu klonlama bölgesi veya MCS olarak adlandırılan bir bölge aracılığıyla plazmite yerleştirilir. Bu bölge, restriksiyon endonükleazları veya restriksiyon enzimleri tarafından kesilen spesifik diziler içerir. Uçların, plazmitin yeni kesilmiş uçlarıyla tamamlayıcı olması için, hedef dizinizi kesmek amacıyla aynı restriksiyon enzimleri kullanılabilir.
Plazmitler ayrıca, replikasyonun gerçekleşeceği noktayı belirten ve ORI olarak kısaltılan bir replikasyon orijini içerir. Transformasyon söz konusu olduğunda, antibiyotik direnç geni hayati öneme sahiptir. Adından da anlaşılacağı gibi bu gen, bakterilerin antibiyotiği nötralize eden bir enzim üretmesini sağlayarak antibiyotik içeren besiyerlerinde hayatta kalmalarına imkan tanır.
Elektroporasyon, elektroporatör adı verilen özel bir cihaz kullanılarak gerçekleştirilir. Hücreler genellikle, yerleştirildiklerinde makine ile elektriksel temas kuran her iki yanında elektrotlar bulunan bir elektroporasyon küvetine yerleştirilir.
DNA ile karıştırılmış bakteri hücreleri elektroporasyon küvetine yüklenir ve birkaç milisaniye boyunca santimetre başına 1000 ila 10.000 volt mertebesinde bir elektrik alanı uygulanır. Bu işlem, membran üzerindeki voltajın 0,5-1 volt değerine ulaşmasına neden olur; bunun, hücre membranını oluşturan fosfolipid çift tabakasının gözenekler oluşacak şekilde yeniden düzenlenmesine yol açtığına inanılmaktadır. Bu durumda plazmid DNA membran boyunca geçer ve darbeleme işlemi tamamlandığında çift tabaka kendini onarır.
Plazmidi alan bakteriler, daha sonra antibiyotik içeren agar plaklarında büyütülebilir.
Plazmidleri ve elektroporasyon mekanizmasını öğrendiğimize göre, işlemin nasıl yürütüldüğüne bir bakalım.
DNA'yı kolayca alabilen hücrelere kompetan hücreler denir. Moleküler biyoloji araştırmalarında transformasyon uygulanan en yaygın kompetan bakteri türü, alt bağırsaklarınızda yaşayan prokaryotik bakteriler olan E. coli'dir. Elektroporasyon için hazırlanan E. coli bakterilerine elektrokometan hücreler denir.
Bakterilerle çalışırken, çalışma alanının mümkün olduğunca temiz olduğundan emin olun.
Bakterilerle çalışmak aynı zamanda aseptik tekniklerin uygulanmasını gerektirir. Bu genellikle, aletleri sterilize etmek ve havadaki kontaminanları çalışma alanından uzak tutan bir konveksiyon akımı oluşturmak için bir Bunsen bek kullanımını içerir.
Elektroporasyondan hemen önce, besiyerini oda sıcaklığına getirin, antibiyotik içeren agar plaklarını 37°C'ye ısıtın ve elektroporasyon küvetlerini buz üzerinde soğutun.
Ardından, yıkanmış elektrokometan hücreleri buz üzerinde çözdürün.
Bakteriyel hücrelere, tuz içermeyen 1ng/μL konsantrasyonunda 1-5uL soğuk plazmid ekleyin, nazikçe karıştırın ve karışımı soğuk küvete aktarın. Hava kabarcığı kalmadığından emin olun.
Elektroporatörün voltaj ve alan gücünü hücreleriniz için uygun ayarlara getirin. Burada, bir elektroporatörün 1700 volt değerine ayarlandığını ve 17kV/cm alan gücü sağladığını görüyorsunuz.
Küvetin dışını kurulayın ve elektroporatöre yerleştirin. Bir bip sesi duyana kadar hücrelere puls uygulayın.
Başarısız puls işlemi, görünür bir kıvılcım ve duyulabilir bir patlama şeklinde gözlemlenebilen bir elektrik boşalmasına neden olur. Ark yapma olarak adlandırılan bu boşalma, kompetan hücrelerinizde veya DNA'nızda çok fazla tuz bulunmasının bir sonucu olabilir.
Transformasyonunuzun başarısı, puls uygulandıktan sonra voltajın sönümlenmesi için geçen süre olan zaman sabitine bakılarak tahmin edilebilir. Tuz mevcut olduğunda ve elektroporasyon solüsyonu çok iletken olduğunda, sönümlenme hızla gerçekleşir, bu da boşalmaya neden olur ve böylece hücrelerinizin çoğunu öldürür. Bakteriler için ideal zaman sabitleri 5-10 milisaniye arasındadır.
Pulstan hemen sonra küveti çıkarın ve doğrudan hücrelerin üzerine 1 ml besiyeri ekleyin. Hücre içeren bu besiyeri bir tüpe yerleştirilir ve hücrelerin toparlanması için 37°C'de 1 saat boyunca çalkalamalı inkübasyona bırakılır.
Ardından, aseptik teknik kullanarak hücreden 20-200uL'yi antibiyotik içeren bir agar plaka üzerine ekleyin. Kondansasyonun hücrelerin üzerine düşmemesi için agar üstte kalacak şekilde plakaları ters çevirin ve 37°C'de gece boyunca inkübe edin.
Plazmid ile transforme olan bakteriler koloni oluşturmalıdır. Kolonileri sayın ve başarılı transformant sayısının plakaya ekilen toplam DNA miktarına bölünmesiyle elde edilen transformasyon verimliliğini hesaplayın.
Bakterileriniz için besin sağlayan agar ve besiyerleri önceden hazırlanmış ve otoklav ile sterilize edilmiş olmalıdır. Sıvı besiyerlerinin kullanım öncesinde oda sıcaklığına soğumasını bekleyin ve agarı, antibiyotiğin eklenebileceği ve plakların dökülebileceği sıcaklık olan 50-55˚C'ye kadar soğutun. Ardından, katılaşmaları için plakların oda sıcaklığına soğumasına izin verin.
Transformasyonda kullanılan bakteriler dondurucuda saklandığından, öncelikle buz üzerinde çözdürülmeli, antibiyotiksiz bir agar plağına yayılmalı ve ardından 37˚C'de gece boyunca büyütülmelidir.
Aseptik teknik kullanarak agar plağından bir bakteri kolonisi seçin ve bunu daha büyük 500mL'lik bir kültürde, çalkalayıcı inkübatörde 37°C'de gece boyunca büyütün.
Hücreler büyürken, yaklaşık bir litre deiyonize su hazırlayın ve hacimce %10 gliserol ve su çözeltisi oluşturun. Çözeltileri otoklavlayın ve 4˚C'de soğumaya bırakın.
Absorbans ölçümleri, bakterilerin DNA'yı kolayca alabilecekleri büyüme evresinin orta logaritmik fazında olup olmadıklarını belirlemek için kullanılır. Hücreler bu evreye ulaştığında, onları buz üzerine yerleştirin ve prosedür boyunca orada tutun.
Ardından, hücreleri iki büyük santrifüj tüpüne ayırarak 4°C'de santrifüjleyip yıkayın, süpernatantı dökün ve soğuk 100mL steril deiyonize su içinde yeniden süspanse edin. Bu adımı en az bir kez daha tekrarlayın. Bu özel adımın amacı, elektroporasyon tekniğini güçlü şekilde etkileyecek olan tuzu uzaklaştırmaktır.
Suda %10 gliserol içeren 50 ml çözelti ile iki ek yıkama daha gerçekleştirin ve son olarak bakterileri aynı çözelti içinde yeniden süspanse edin.
Birden fazla Eppendorf tüpüne 50μL hücre ekleyin. Bu hücreler artık elektroporasyonda kullanım için hazırdır ve 4˚C'de tutulmalıdır. Alternatif olarak, şok dondurularak -80˚C'de saklanabilirler.
Göreceğiniz üzere, elektroporasyonun birçok uygulama alanı vardır.
Elektroporasyona bir alternatif, DNA'yı hücrelere aktarmak için bakterilerin hem kalsiyum klorüre hem de ısıya maruz bırakılmasına dayanan ısı şoku transformasyonudur.
Genel olarak ısı şoku, bakteriler için elektroporasyondan daha yumuşak bir yöntemdir ve düşük tuz konsantrasyonu gerektirmez. Hedef geninizin plazmide yerleştirilmesini içeren ligasyon reaksiyonları, doğrudan ısı şoku transformasyonunda kullanılabilir. Isı şoku transformasyonu, elektroporasyondan daha ucuzdur ve pahalı ekipmanlara veya küvetlere ihtiyaç duymaz. Öte yandan, ısı şoku, elektroporasyona göre daha düşük transformasyon verimliliğine yol açar ve daha uzun sürer. Ayrıca ısı şoku; bakteri, maya ve bitki protoplastları ile sınırlıyken, elektroporasyon memeli hücrelere de uygulanabilir.
Burada, fare embriyonik fibroblastlarının bir elektroporasyon küvetine yüklendiğini görüyorsunuz. Elektroporasyon tamamlandığında, transformasyon verimliliği, hücrelerin plazmit tarafından kodlanan yeşil floresan proteini üretme düzeyi gözlemlenerek belirlenebilir. Memeli hücrelerin transformasyonuna transfeksiyon adı verilir; bu işlem genellikle bakteriyel hücrelere göre daha düşük alan şiddetleri ve daha yüksek zaman sabitleri gerektirir.
Elektroporasyon, burada gördüğünüz gelişmekte olan civciv embriyosu gibi bütün hayvanlarda da gerçekleştirilebilir. Plazmit DNA civcivin beynine enjekte edilir ve ardından beyin dokusuna bir elektrik alanı uygulamak için bir elektroporasyon probu kullanılır. Bir veya iki gün sonra, plazmit tarafından kodlanan yeşil ve kırmızı floresan proteinler nöronlar tarafından sentezlenir ve bilim insanları gelişmekte olan civciv beynindeki yapısal değişiklikleri gözlemleyebilir.
Elektroporasyon yoluyla bakteriyel transformasyona giriş JoVE videosunu izlediniz. Bu video, en yaygın transformasyon yapılan DNA tipi olarak plazmidi tanıttı, elektroporasyonun temelinde yattığı düşünülen biyofiziksel mekanizmayı tartıştı, elektroporasyon gerçekleştirme için genel bir prosedürü gösterdi ve elektroporasyonun memeli sistemlerinde nasıl kullanılabileceğini açıkladı. İzlediğiniz için teşekkürler!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is a plasmid and why is it used in bacterial transformation?
A plasmid is a small, circular, extrachromosomal piece of DNA that acts as a vector to carry your specific DNA sequence into bacterial cells. It contains a multiple cloning site where restriction enzymes insert your target gene, an origin of replication for DNA copying, and an antibiotic resistance gene that allows transformed bacteria to survive on antibiotic-containing media.
Q2: How does electroporation create pores in bacterial cell membranes?
Electroporation applies a high-voltage electric field of 1,000 to 10,000 volts per centimeter for milliseconds, causing the voltage across the membrane to reach 0.5-1 volts. This rearranges the phospholipid bilayer, creating temporary pores through which plasmid DNA passes. Once pulsing stops, the bilayer repairs itself, trapping the DNA inside the cell.
Q3: What are electrocompetent cells and how are they prepared?
Electrocompetent cells are bacteria prepared to readily take up DNA during electroporation. E. coli cells are grown to mid-log phase, then washed multiple times in deionized water and 10% glycerol solution to remove salt. Salt removal is critical because high salt content causes arcing, an electrical discharge that kills cells and indicates transformation failure.
Q4: Why is the time constant important in predicting electroporation success?
The time constant measures how quickly voltage decays after the electric pulse is applied. Good time constants for bacteria range from 5-10 milliseconds. Rapid decay indicates high salt concentration, causing arcing and cell death. Monitoring the time constant helps predict whether your transformation will succeed before observing colony growth.
Q5: How does electroporation compare to heat shock transformation?
Heat shock transformation uses calcium chloride and heat exposure instead of electrical pulses, making it gentler on bacteria and cheaper than electroporation. However, heat shock produces lower transformation efficiencies, takes longer, and works only on bacteria, yeast, and plant protoplasts. Electroporation achieves higher efficiency and applies to mammalian cells through a process called transfection.
Q6: What steps follow electroporation to identify successfully transformed bacteria?
After pulsing, add recovery media to cells and incubate at 37°C for one hour with shaking. Plate cells on antibiotic-containing agar and incubate overnight at 37°C. Only bacteria that successfully took up the plasmid survive the antibiotic. Count resulting colonies and calculate transformation efficiency by dividing successful transformants by total DNA plated.
Q7: What are the applications of electroporation beyond bacterial transformation?
Electroporation applies to mammalian cells through transfection, using lower field strengths and higher time constants than bacterial cells. Scientists also use electroporation in whole organisms like developing chicken embryos by injecting plasmid DNA into brain tissue and applying an electric field. This allows observation of fluorescent protein expression and structural changes in developing neural tissue.
Bu videodaki bölümler
0:00
Overview
0:47
The Plasmid
2:17
Electroporation Basic Principles
3:26
Electroporating Bacteria
7:07
Preparing Electrocompetent Cells
9:36
Applications
11:43
Summary