Astrositik Transporter Akımlar bir Dekonvolüsyon Analizi ile Glutamat Gümrükleme gün Dersin türetilmesi

Deneyin genel amacı, uyarıcı sinapslardan salınmasını takiben astrositik membranlardan glutamat klerensinin zaman seyrini tahmin etmektir. Bu süreçteki ilk adım, geniş spektrumlu glutamat taşıyıcı antagonisti TBOA'nın alt doygunluk konsantrasyonunun yokluğunda ve varlığında akut beyin dilimlerindeki astrositlerden sinaptik olarak aktive edilmiş glutamat taşıma oluşumunu kaydetmektir. İkinci adım, sinaptik olarak aktive edilmiş glutamat taşıyıcı akımlarını, uyarılan yanıtın diğer tüm bileşenlerinden izole etmek için kayıtları analiz etmektir.

Daha sonra, filtre süresi seyri, TBOA varlığında kaydedilen taşıyıcı akımların, kontrollü koşullarda kaydedilen taşıma oluşumundan filtreyi içeren de tarafından analiz edilmesiyle tahmin edilir. Astrositik membranlardan glutamat klirensinin zaman seyri elde edilir. Sonuçlar, fare hipokampusunda astrositlerin, sinaptik olarak salınan glutamatın hücre dışı uzay tabanından çıkarılması için sadece birkaç milisaniye gerektirdiğini göstermektedir.

Bu yaklaşım, fizyolojik ve patolojik durumlar sırasında farklı beyin bölgelerindeki astrositik alım kapasitesindeki değişiklikleri tespit etmek için hassas bir araç sağlar. Bu yaklaşımın, örneğin, floresan glutamat göstergelerinde hızla ayrışan glutamat reseptör antagonistlerinin yer değiştirme analizine veya difüzyon reaksiyonu bilgisayar simülasyonlarına dayanan diğer yöntemlere göre ana avantajı, astrositlerden glutamat klerensinin yüksek zamansal çözünürlüklü, doğrudan deneysel bir okumasını sağlamasıdır. Bu yöntem, beyindeki sinaptik iletimin uzamsal ve zamansal dinamiklerini anlamamızı sağlar.

Alzheimer hastalığı gibi bazı nörolojik bozukluklarda meydana gelebilecek glutamat, difüzyon ve alımdaki patofizyolojik değişiklikleri yorumlamamıza yardımcı olabilir. Bu prosedüre, disseke edilmiş bir fare beyninde bir neşter ile beş kesim yaparak başlayın. İlk olarak, koku soğancıklarını ve frontal korteksi çıkarın.

İkinci olarak, beyinciği çıkarın. Ardından, sol ve sağ temporal lobları çıkarın. Daha sonra iki beyin yarım küresini orta sagital kesim ile ayırın.

Ardından, her bir beyin bölümünün yan yüzeyini soğuk vibram taban plakasına yapıştırın. Beynin sırt tarafı Vibram bıçağına bakmalı ve beynin ventral tarafı vibrato bıçağından uzakta agar bloğu ile temas halinde olmalıdır. Ardından vibrato taban plakasını diseksiyon odasına sabitleyin.

Dilim kalınlığını 250 mikrometreye ayarlayın ve dilimlemeden önce bıçağın genişliğini ayarlayın. Bıçak korteks ve hipokampustan geçtikten sonra, korteks hipokampusunu orta beyinden kesmek için bir neşter kullanın. Daha sonra, dilimleri 30 dakika boyunca 34 santigrat derecede tuttuktan sonra 34 santigrat derecede daldırma odasına bir dilim yerleştirin.

Elektrofizyoloji kayıtları için kullanmadan önce 30 dakika oda sıcaklığına soğumalarını bekleyin Bu prosedürde, bir dilimi kayıt odasına aktarın. Nokta aydınlatması veya I-R-D-I-C altındaki dilimi görsel olarak inceleyin. Astrositler, sinaptik stimülasyon için küçük hücre gövdeleri ve belirgin çekirdekleri ile tanımlanabilir.

Bipolar paslanmaz çelik bir elektrotu, yama yapmayı planladığınız astrositten yaklaşık 100 mikrometre uzağa yerleştirin. Astrositi yamalayın ve çok yumuşak bir emme uygulayarak tüm hücre konfigürasyonunu kırın. Daha sonra, sinaptik olarak aktive edilmiş taşıma oluşumunun kolaylaştırılmış kısımlarını izole etmek için her 10 ila 20 saniyede bir alternatif tek ve çift uyaranlar.

İlk olarak, kontrollü koşullarda eşleştirilmiş stimülasyonlarla ve 10 mikromolar geniş spektrumlu glutamat taşıyıcı antagonisti varlığında elde edilen ortalama en az 20 tarama. TBOA daha sonra kontrol koşullarında tek stimülasyonlarla elde edilen aynı sayıda taramanın ortalamasını alır ve 10 mikromolar TBOA'da, eşleştirilmiş stimülasyonlarla elde edilen ortalama izi, tekli stimülasyonlarla elde edilen ortalama izden çıkarır. Bu adım, STO geometrik ve ikinci uyaran tarafından uyandırılan sürekli potasyum akımının izole edilmesine izin verir.

Bir sonraki vardiya, eşleştirilmiş darbeler iletmek için kullanılan PUL aralığıyla eşleşen bir zaman aralığı ile tek stimülasyonlarla elde edilen ortalama iz, kaydırılan zamanı, daha önce elde edilen ikinci uyarana verilen ortalama yanıttan tek stimülasyonlarla elde edilen ortalama yanıtı çıkarır. Bu adım, ikinci uyaran tarafından uyarılan taşıyıcı akımının kolaylaştırılmış bir bölümünü izole eder. Çoğu durumda, bu adım sürekli potasyum akımını tamamen ortadan kaldırır.

Bu durumda, FSTC'nin izolasyonu tamamlanmıştır ve evrişim analizine devam edebilir ve astrositlerden glutamat klirensinin zaman seyrine ulaşabilirsiniz. Bununla birlikte, bazı durumlarda, küçük bir sürekli potasyum akımı hala mevcuttur ve daha fazla analiz gereklidir. Performanstan sonra kalan sürekli potasyum akımının genliğini ölçün.

Daha önce açıklanan analiz, ölçülen sürekli potasyum akımının genliğini bu denklemde a olarak ayarlayarak mono üstel fonksiyonun genliğini artık sürekli potasyum akımının genliğine ölçeklendirir. Ancak yükselme süresi sabiti, sürekli bir potasyum akımının izole edildiği ayrı deneylerde tahmin edilen ortalama yükselme değerini temsil eder. Farmakolojik olarak, yüksek doymuş bir TBOA konsantrasyonu kullanarak, elde edilen mono üstel fonksiyonu FSTC'den ve sürekli potasyum akımından çıkarın.

FSTC'nin izolasyonunu tamamlamak için. Flaşı aktif hale getiren taşıma oluşumunu izole etmek için. Kontrol koşullarında ışık yolu açıkken elde edilen en az 20 taramanın ortalaması ve 10 mikromolar TBOA'da, kontrol koşullarında ışık yolu kapalıyken elde edilen aynı sayıda taramanın ortalaması alınır ve 10 mikromolar TBOA'da, ışık yolu açıkken elde edilen ortalama izden bloke edilen ışık yolu ile elde edilen ortalama izi çıkarın.

Bu adım, uyaran artefaktının çıkarılmasına ve FTC'lerin izole edilmesine izin verir, bu adımda kontrol koşullarında ve 10 mikromolar TBOA'da kaydedilen FSTC veya FTC taşıma akımına uyun ve bunları çok üstel bir fonksiyonla eşleştirin, bu fonksiyona göre mono üstel olarak azalan ve 10 mikromolar TBOA'da kaydedilen taşıyıcı Akımın bozunma fazını en iyi tanımlayan anlık yükselen bir fonksiyon oluşturun. Daha sonra, filtreyi türetmek için mono üstel fonksiyonu 10 mikromolar TBOA'da kaydedilen taşıyıcı akımın uyumundan geçirin. Ardından, filtreyi kontrollü koşullarda taşıyıcı akımının uyumundan çıkarın.

Glutamat klerensinin toplam zaman seyrinin nicel bir tahminini elde etmek için, bu prosedürü denerken dalga formunun OID'sini hesaplayın. Taşıma oluşumunun, filtrenin doğrusal bir rejimde çalıştığı ve taşımanın yalnızca doğrusal bozulmalarını ortaya çıkardığı deneysel koşullar altında kaydedildiğini doğrulamak önemlidir. Bunlardan gelen akım dalgası, taşıma akımının boyutunu değiştiren manipülasyonları kontrol ederek yapılabilir.

Damga rotasını değiştirmeyin. Bu videoyu izledikten sonra, beyindeki glutamat, difüzyon ve alım hakkında bilgi elde etmek için astrositik kayıtların nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.