Prostat Kanserinde Biyomarker Discovery Uygulama: Bireysel herv Lokusları İfade Mikroarray tabanlı Kimlik

İnsan prostat kanseri dokularının bu Transkriptomik analizi, biyobelirteç keşfi için bir tarama aracı olarak özel bir yüksek yoğunluklu mikrodiziyi değerlendirmek için bireysel insan endojen retrovirüs ekspresyon lokuslarını tanımlar. Cerrah prostat organını hastadan çıkardıktan sonra, patolog tümöral ve bitişik normal dokuları laboratuvar ekstraktında ayrı ayrı hazırlar, saflaştırır ve MR'yi nitelendirir. Normal ve tümöral dokulardan NA, tüm transkriptom ovasyon kitini kullanarak mRNA'ları amplifiye eder ve daha sonra elde edilen amplifiye ürünleri parçalar ve etiketler. Daha sonra H-E-R-V-V iki mikrodizisini doldurarak, hibridize ederek, yıkayarak ve tarayarak sırayla işleyin.

Sonuç olarak, biyohesaplama yöntemleri kullanılarak, önemli sinyal ve diferansiyel ekspresyon sergileyen prob setleri, transkripsiyonel olarak aktif bireysel lokusların tanımlanmasına yol açan izlenebilir. Yıllar önce, multipl skleroz örnekleri de dahil olmak üzere IRV W ailesinin davranışını çeşitli bağlamlarda araştırdık. Plasenta testisi.

Yöntemi hakkında ilk olarak, bir aile içindeki IRV öğelerinin örtüşen veya örtüşmeyen alt gruplarının ifade edildiğini anlamaya başladığımızda aklıma geldi. İçeriğe bağlı olarak. Gemi teknolojisinin kullanılması, birkaç ailenin koordineli bir şekilde araştırılmasına ve her lokus için farklı bölgelerin aynı anda analiz edilmesine olanak tanır.

Örneğin, patolojide doğrudan bir rolü destekleyebilecek LTR için US üç ve UF alanı. Bu yöntem, PSA gibi mevcut protein biyobelirteçlerinin özgüllük ve duyarlılıktan yoksun olduğu prostat kanseri teşhisi gibi kanser alanındaki önemli soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu arada, PCA üç gibi kodlamayan RNA daha umut verici görünüyor, Prostat işleme prosedürünü göstermek, patoloji bölümünden bir teknisyen satacak.

Philippe per, RNA ekstraksiyon hedefinin hazırlanmasını ve analizini gösterirken, John Unit laboratuvarından bir teknisyen gemi prosedürünü gösterecek. Donmuş doku seyrini, kriyostattaki küçük bir OCT höyüğü üzerine dikey olarak monte edin. Beş mikronluk tek bir kesit alın, Bluudine ile boyayın, ardından tümöral doku için dokunun doğasını incelemek için hızlı bir histolojik inceleme yapın.

Tural hücrelerin miktarını tahmin edin ve yalnızca %80'den fazla tümöral hücre içeren çekirdekleri seçin. Beş mikronluk bir bölüm daha kesin ve hematin, eoin ve safran ile boyayın. Şimdi 30 mikron kalınlığında 15 bölüm kesin ve bunları RNA'sız bir orph tüpüne aktarın.

Daha sonra tümöral hücrelerin miktarını kontrol etmek için hematin, eoin ve safran ile boyama için son beş mikronluk bir bölüm alın. İşlemin sonunda, numuneler kuru buz üzerinde moleküler biyoloji laboratuvarına trans olarak aktarılır. Doku tamamen eriyene kadar elde taşınan bir öğütücü kullanarak buz üzerinde Triol çözeltisindeki dokuyu homojenize edin.

Numuneleri oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Sonra 300 mikrolitre kloroform ekleyin ve 15 saniye boyunca girdap yapın. Oda sıcaklığında iki dakika sonra, iki ila sekiz santigrat derecede 15 dakika boyunca 12.000 G'de santrifüjleyin.

RNA için, üst sulu fazı dikkatlice yeni bir tüpe aktarın. 750 mikrolitre izopropanol ekleyin, ters çevirerek karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Çökeltilmiş RNA'yı peletlemek için numuneleri santrifüjleyin, RNA peletini bir mililitre %80 etanol ile yıkayın.

Daha sonra numuneleri 7.500 G'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. P 1000 ve P 10 uçlarını kullanarak süpernatanı çıkarın. Kalan etanolün kurumasına izin verin.

Ardından, 100 mikrolitre RNA içermeyen su ekleyin. Numuneleri 70 santigrat derecelik bir ısı bloğuna aktarın. Peleti çözmek için, üreticinin talimatlarına göre bir biyoanalizör ve bir NanoDrop kullanarak RNA'nın kalitesini ve RNA bütünlüğünü kontrol edin.

İdeal bir RNA ekstraksiyonunda, RNA bütünlük sayısı tipik olarak yedi veya daha fazladır. Tedarikçiden gelen talimatları izleyerek tüm transkriptom ovasyonu, RNA amplifikasyon kiti ile devam edin. Daha sonra elde edilen tek sarmallı CD NA ürününü saflaştırın.

Üreticinin talimatlarına göre bir biyoanalizör ve bir NanoDrop kullanarak tek sarmallı CDNA'nın verimini ve boyut dağılımını kontrol edin. Amplifiye edilmiş CD NA'nın boyut dağılımı tipik olarak 101.500 baz uzunluğunda, tepe noktası yaklaşık 600 baz arasında olmalı ve genel olarak çan şeklinde bir dağılıma sahip olmalıdır. CDNA'yı parçalamanın ardından, 30 mikrolitre dönüşte iki mikrogram CD NA'ya 6.6 mikrolitre parçalanma karışımı ekleyin ve 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin.

Daha sonra DNA'nın DNA'sını 95 santigrat derecede 10 dakika boyunca etkisiz hale getirin ve buz üzerinde tutun. Agilent tabanlı boyut dağılımı doğrulaması için parçalanmış CDNA'nın bir mikrolitresini alikot edin. DNA'nın bir işlemi, hibridizasyondan önce CD NA boyut dağılımını yaklaşık 100 nükleotid kadar homojenize eder.

Bir biyoanalizör Pfizer ön ıslak kullanarak tek sarmallı CD NA boyut dağılımını kontrol edin. 200 mikrolitre ön hibridizasyona sahip HERV gen çipi. Karıştırın ve 50 santigrat derecede, 60 RPM'de 10 dakika inkübe edin.

69 mikrolitre parçalanmış ve etiketlenmiş CD NA'ya 131 mikrolitre hibridizasyon karışımını oda sıcaklığında ve doğada 95 santigrat derecede iki dakika boyunca ekleyin. Daha sonra 50 santigrat derecede beş dakika inkübe edin ve beş dakika boyunca maksimum hızda santrifüjleyin. Şimdi önceden ıslatılmış HERV gen çipini boşaltın ve 200 mikrolitrelik hedef hazırlığını yükleyin.

İki SEPTA hibridizasyonuna 50 santigrat derece, 60 RPM'de 18 saat boyunca sert noktalar uygulayın. HERV gen çipini boşaltın ve probu doldurun. 250 mikrolitre yıkama tamponu, 600 mikrolitre SAPE solüsyon karışımı ve 600 mikrolitre antikor solüsyonu karışımı ile bir ve iki numaralı konumlara yerleştirin, 800 mikrolitre dizi tutma tamponunu konumuna yerleştirin.

Üç numara, iğneleri aşağı doğru itin. Her modüle doğru çipi atayın. FS 4 5 0 0 0 4 protokolünü seçin ve her modülü yazılımın talimatına göre çalıştırın.

Sızıntıyı önlemek için SEPTA'ya sert noktalar uygulayın. Ardından çipi otomatik yükleyiciye veya alternatif olarak doğrudan tarayıcıya yükleyin. Taramayı başlatın.

Çip noktasını taradıktan sonra CEL dosyaları oluşturulur, görüntüyü kontrol edin ve prob hücrelerini tanımlamak için ızgarayı noktaya hizalayın. Ayrıca çipleri çeşitli kalite kontrol ölçümlerine tabi tutun. Şimdi çipleri normalleştirin ve veri setini keşfetmek için hiyerarşik bir kümeleme yaklaşımı uygulayın Normalleştirmeden sonra, mikrodizi prosedüründen diferansiyel olarak ifade edilen genleri aramak için önemli analizler yapıldı ve ardından beş eşleşme çifti tümör ve normal prostat RNA örneklerinde yanlış bir keşif oranı düzeltmesi yapıldı.

Bu, diferansiyel ifade değerlerine sahip 207 HERV prob setinin tanımlanmasına yol açtı. Diğer kanser dokularından alınan 35 ek eşleşme çifti örneğinin daha ileri analizi, 44 prostat spesifik HERV prob seti tanımladı. Bunlar en alakalı 10 HERV yapısıdır.

Son olarak, fonksiyonel analiz, H-E-R-V-V iki dizisinde bulunan ve fonksiyonel retroviral bölgeler LTR gag POLE N ile etiketlenen ve beş asal LTRU üç ve U beş alt alana odaklanarak, ilk 10 tanımlanmış proviral yapıda seçilen bir H-E-R-V-W elemanı tarafından gösterilen açıklamalı ilgi dizilerinden oluşan özel bir arayüzde gerçekleştirilebilir. ve RT PCR validasyonu için müteakip PCR primerlerinin tasarımı. Bu videoyu izledikten sonra, geleneksel biyo işaretleyici keşfinin yanı sıra dünya için mikro ışın kullanımında başarılı olmak için kalite ön koşulları olan numune ve hedef hazırlamada yer alan kritik adımlarda nasıl ustalaşacağınızı iyi anlamış olmalısınız. Ametri formatında yüksek yoğunluklu bir mikrodizi tasarladık, kuru non-con alan NA transkripsiyonu veya kodlama gen ekspresyonunu modüle ederse aktif olup olamayacaklarını daha iyi anlamak için lokus ekspresyonunun bireylerini en iyi şekilde karakterize etmeyi amaçladık.

Bu teknik, kronik ve bulaşıcı hastalıklar alanındaki araştırmacıların önünü açmaktadır, çünkü aktif voci'lerin sistematik olarak tanımlanması, çeşitli patolojilerde tetikleyici faktörler olarak genetik, viral ve çevresel hipotezleri birleştirebilir. Teknik bir kavram kanıtı deneyinde sınırlı sayıda örnekle çalışmak, biyobelirteçleri başarılı bir şekilde keşfetmek, yöntemin sağlamlığı da dahil olmak üzere istatistiksel olarak doğrulanmış bir iş akışına saygı duymak ve hedeflenen hasta popülasyonunun temsili bir örneklemesini almak gibi önlemler almak için zor olabilir.