Plant protein kompleksleri, çevirim sonrası değişikliklerin belirlenmesi

Bu prosedürün genel amacı, bitki protein komplekslerinde yer alan proteinlerin translasyon sonrası modifikasyonlarını ilk olarak geçici veya stabil bir şekilde plana ilgilenilen protein etiketlerinde ifade etmektir. Daha sonra bitkinin dokusundan toplam proteinleri çıkarın ve ilgilenilen proteini immüno-çökeltin. Daha sonra, immüno-çökeltilmiş proteinleri bir akrilamid jel üzerinde ayırın ve proteinleri ilgilenilen jel bandından çıkarın ve sindirin.

Şimdi protein örneklerini kütle spektrometresi için gönderin. Sonuç olarak, kütle spektrometresinin sonuçları, fosforilasyon gibi translasyon sonrası modifikasyonlardaki dinamik değişiklikleri tespit edebilir. Kinazın substrat ile in vitro inkübasyonu gibi alternatif yöntemlerin aksine, bu yöntem ekicideki proteinleri eksprese eder.

Bu nedenle, fosforilasyondan hangi kinazın sorumlu olduğunu bilmek zorunda değilsiniz. Bu yöntem, strese, çevresel değişikliklere veya patojen tanımaya yanıt olarak sinyallerin nasıl iletildiği gibi bitki biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Fosforilasyonun, aktive edilmiş direnç protein komplekslerinin bölgelerinin tanımlanmasına ek olarak, bu yöntem, herhangi bir bitki protein kompleksinin herhangi bir translasyon sonrası modifikasyonuna geniş çapta uygulanabilir.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, büyük miktarda ekstrakt ile çalışmaya ve tek bir günde protokolün daha fazla adımını gerçekleştirmeye alışkın olmadıkları için mücadele edeceklerdir. Geçici ifade için, agrobacterium tohin suşlarını sabit faza yükseltin. Agro bakterileri beş dakika boyunca 3000 Gs'de santrifüjleme ile hasat edin.

Peletleri ve sızma tamponunu yeniden askıya alın. Arabellek. Şimdi sızıyor. Sızmadan iki ila beş gün sonra, bir mililitre iğnesiz şırınga kullanarak veya %0.02 yüzey aktif madde ile vakumla manuel olarak agro bakterili dört haftalık NCOA hamana bitkileri.

Sızan yaprakları, yaprakları hasat edin, sıvı nitrojen içinde dondurun ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Daha sonra, 20 gram bitki dokusunu ve sıvı azotu bir havan ve havan tokmağı kullanarak 80 mililitre soğuk tampon C'de 20 grama öğütür. İyice karıştırın ve buz üzerinde çözdürün.

Şimdi her biri 10 saniyelik üç patlama ile tam hızda homojenize edin. Homojenatı filtreleyin ve dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 30.000 Gs'de santrifüjleyin. Bu arada, 500 mikrolitre soğuk bloke edici tampon D'de 100 mikrolitre uygun afinite matrisine dört santigrat derecede beş dakika süreyle ve bir mililitre soğuk tampon D ile üç kez yıkanır.Daha sonra, yaprak ekstraktının süpernatını çıkarın ve 0.45 mikrometrelik bir şırıngadan geçirin.

Buz üzerinde yeni bir tüpe süzün. Ham özü aliquot. Bir immün leke için.

Beş XSDS sayfa yükleme arabelleği girdabı ekleyin ve denatüre etmek için örnekleri kaynatın. Her tüpe D tamponunda asılı 50 mikrolitre afinite matrisi ekleyin. Dört santigrat derecede iki saat boyunca hafif rotasyonla inkübe edin, afinite matrisini peletlemek için santrifüjleyin.

Daha sonra bir immün leke için bağlanmamış ekstraktın bir alikotunu alın. Aklın geri kalanını atın ve tüpün dibinde yaklaşık 500 mikrolitre bırakın. Bulamaç çözeltisini geniş delikli bir uçla yeniden süspanse edin.

Karışık bulamaç çözeltisini her iki tüpten tek bir 1.5 mililitrelik tüpe toplayın. Afinite matrisini çökeltmek için bir tezgah üstü santrifüj kullanarak beş saniye boyunca üç kez vurun ve bir mililitre soğuk tampon D ile üç ila beş yıkamadan sonra süpernatı çıkarın, fazla tamponu D bir şırınga iğnesi ile çıkarın, sürekli çalkalama altında 200 mikrolitre uygun elüsyon tamponu ile çıkarın. Üç EIT'yi tek bir tüpte çekin.

Daha sonra 30 mikrolitre absorpsiyon reçine girdabı kullanarak proteinleri konsantre edin. Beş dakika bekletelim ve reçineyi çökeltelim, süpernatı atalım. Çökeltilmiş afinite matrisine veya absorpsiyon reçine girdabına 50 mikrolitre bir XSDS sayfa yükleme tamponu ekleyin ve bir ısı bloğu santrifüjünde 80 ila 100 santigrat derecede 10 dakika kaynatın.

Kaynatılmış afinite matrisi, 10.000'de iki dakika boyunca reçinedir. GS, immünoblok için süpernatın beş mikrolitresini alır ve diğer fraksiyonlarla birlikte 10 santimetre uzunluğundaki bir SDS sayfasına çalıştırır. Fosforile proteinlerin kütle spektrometresi ile ayrılması ve tanımlanması için jel.

Kalan 45 mikrolitreyi bir SDS sayfa jel lekesine yükleyin. Kolloidal kamasi parlaklık mavisi ile SDS sayfa jeli. Daha sonra jeli, tercihen gece boyunca bol yıkama ve su ile alıkoyun.

Şimdi temiz bir neşterle, jel dilimini iki ila dört milimetrelik küpler halinde zar atıp numuneyi bir tüpe aktarın. Jel parçalarını %50 aseto nitril ve 50 milimolar amonyum bikarbonat ile leke kalana kadar yıkayın. Ardından çözeltiyi pipetleyin.

Jel parçalarını çıkarmamaya dikkat edin. Numuneyi beş dakika boyunca %100 aseto nitril ile kurutun ve serbest sıvıyı çıkarın. Daha sonra protein di sülfür bağlarını 10 milimolar DTT'de azaltmak ve 56 santigrat derecede 30 ila 45 dakika çalkalayarak inkübe etmek için, sistein kalıntılarını alkillemek için serbest sıvıyı şimdi çıkarın.

Karanlıkta oda sıcaklığında 20 ila 30 dakika boyunca 55 milimolar kloro Asetamid ekleyin. Serbest sıvıyı çıkarın, ardından jel parçalarını 10 dakika boyunca %50 Aseton nitril ile iki kez yıkayın. Serbest sıvıyı çıkarın.

Şimdi jel parçalarını %100 aseto nitril ile beş dakika kurutun ve Triptych Digest için serbest sıvıyı çıkarın. 40 mikrolitre tripsin çalışma solüsyonunda, jel parçalarının üzerini örtmek için yeterli sindirim tamponunda 10 dakika boyunca jel parçalarının yeniden sulanmasına izin verin. Sindirimi durdurmak için gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin ve peptitleri jel parçalarından beş ila 10 dakika boyunca% 5 formik asit sonikatta çıkarın.

Daha sonra süpernatı yeni bir tüpe aktarın, peptitleri liyofilizasyon veya vakum yoğunlaştırıcı ile kurutun ve numuneleri eksi 20 santigrat derecede saklayın. Bu deney, P-R-F-P-T-O kinaz kompleksini nacoa hamana'dan saflaştırır, 35 SPTO eksprese eden bir transgenik NACOA hamana, 35 SPRF bayrağı ile geçici olarak dönüştürüldü ve kompleks, Anti-Flag M iki aro ile immüno-çökeltildi. İmmüno lekeler, antikor tespiti ve kütle spektrometresi analizi ile gösterildiği gibi PRF ile birlikte saflaştırılmış hem PTO hem de etkileşimli efektör protein olan hedeflenen PRF proteininin verimli immünopresipitasyonunu gösterir.

Buradaki strateji, Anti-Flag ile PTO proteinini hedeflemekti. Strateji değiştirildi. PTO fosforilasyon bölgelerini tanımlamak için.

Hem PRF kompleksini hem de serbest formu içeren toplam PTO proteini miktarı, Anti-Flag M iki aros ile immüno-çökeltildi ve SDS sayfa fraksiyonlaması, ingel triptik sindirimi ve kütle spektrometrik analizine tabi tutuldu, bu da dizisinin yaklaşık% 80'ini kapsayan PTO peptitleri ile sonuçlandı. İlginç bir şekilde, PTO peptitleri için bir dizi tek fosforilasyon bölgesi tanımlandı. Çift fosforilasyon bölgelerinin yalnızca her iki efektör proteinin varlığında tanımlandığına dikkat edin.

Bir protein kompleksinin bileşenlerini tanımlamak ve ayrıca ilgilenilen bir proteinin translasyon sonrası modifikasyonunu tespit etmek için yeterli bitki proteini miktarları elde etmek önemlidir. Fosforilasyon gibi haritalama modifikasyonlarının kütle spektrometresinden makul miktarda protein gerektirdiğini unutmayın, bu nedenle bu prosedürü takiben jelinizde en azından soluk bir bant belirgin olmalıdır. I gibi diğer yöntemler, karmaşık bileşenlerin tanımlanması, bağışıklık kompleksi aktivasyonunun fonksiyonel bağışıklığa nasıl yol açtığı gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir.

Organik tamponlar, bakteriler ve jilet BBL'leri ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın, bu nedenle eldiven ve kucak montu giymek gibi önlemler alın.