Floresan Etiketli Vaksinia Virüs Proteinlerinin Verimli Üretimi için Metodoloji

Bu deney, geçici dominant seçime dayalı modüler ve hızlı bir yöntemle floresan işaretli rekombinant vaccinia virüsleri üretmektedir. İlk olarak, sentezlenmiş minimal homoloji bölgeleriyle çevrelenmiş bir floresan etiketin yanı sıra metabolik ve floresan seçim için belirteçler içeren bir rekombinant vektör oluşturun. Bu rekombinasyon vektörünü enfekte hücrelere transfekte edin ve metabolik seçim ile floresans kullanarak rekombinant virüsleri amplifiye edin. Ardından, belirteç kasetini çıkarmak için metabolik seçimi kaldırın ve floresan belirteç seçimi ile rekombinant virüsler içeren hücreleri izole edin. Hücre monokatmanlarındaki viral plak sonuçları, floresan işaretli gene özgü bireysel virüs partiküllerinin görselleştirilmesini sağlar.

Bu yöntemi, etiketden bağımsız olarak tekrar tekrar ve evrensel olarak kullanılabilecek bir seçim yöntemiyle birden fazla genetik modifikasyona sahip rekombinant virüsler üretmek amacıyla geliştirdik. Geçici baskın seçimin prensibi daha önce tanımlanmış olsa da, genomik modifikasyonlar yaparken bize daha fazla esneklik sağlaması için bu yöntemi daha geniş bir ölçekte ve modüler bir şekilde uygulamak istedik. Rekombinant viral plak taraması ve izolasyonu zorlayıcı olabildiğinden, bu yöntemin görsel bir gösterimi kritik öneme sahiptir. Plakların sıklığı düşük olabilir ve bu nedenle virüsün verimli bir şekilde geri kazanılması için bazı özgün yöntemler gereklidir.

Böylece, ilgilenilen viral geni proteinin N veya C terminusünde etiketleyin. Buna uygun olarak, 150 baz çifti uzunluğundaki flanke edici homoloji bölgelerini belirleyin. Ardından, seçilen bir restriksiyon bölgesi çifti ile ayrılmış 150 baz çiftlik sol ve sağ kolları içeren bir oligonükleotid dizisi tasarlayın. Ayrıca, sentezlendikten sonra TDS vektörüne entegrasyonuna olanak sağlamak için bu bölgeyi, ilk çiftten farklı olan ikinci bir restriksiyon bölgeleri çifti ile çevreleyin. Şimdi, restriksiyon bölgelerini içeren oligonükleotidin istenen ekleme bölgesiyle aynı çerçevede (in frame) olacak şekilde tasarlandığını doğrulayın. Oligonükleotid sentezi için, sol ve sağ kollar arasına yerleştirilen restriksiyon bölgelerinin, seçilen floresan etiketinin açık okuma çerçevesini çevreleyen bölgelerle eşleştiğinden emin olun. PCR yoluyla floresan etiketin her iki yanına aynı restriksiyon bölgelerini ekleyin. Sentezlenen fragmanı TDS vektörüne klonlayın. Ayrıca, sol ve sağ homoloji kol bölgeleri arasındaki restriksiyon bölgelerini kullanarak floresan etiketi ortaya çıkan rekombinasyon vektörüne klonlayın. Serum içermeyen ortamda bir BS-C-one hücre monokatmanını vaccinia virüsü ile enfekte edin.

Enfeksiyondan bir saat sonra, hücreleri Dulbecco's modified eagle medium ile kurtarın. Rekombinasyon vektör plazmidi ve transfeksiyon reaktiflerini, serumsuz medyada üçte bir oranında bir karışımla transfekte edin. 24 saat sonra, fetal bovine serum içermeyen DMEM içinde hücreleri sıyırarak toplayın. Hücreleri parçalamak ve virüs partiküllerini serbest bırakmak için üç kez dondurma-çözme döngüsüne tabi tutun. Ardından, tekil plakların yeterli şekilde ayrımını sağlamak için, %100 konfluen BS-C-one hücresi monoton katmanlarını, virüs partikülleri preparasyonunun seri dilüsyonları ile enfekte edin. %10 FBS ve DMEM ile GPT seçici reaktifleri içeren sıvı ile üst katman oluşturun ve 24 saat boyunca inkübe edin.

Sıvı üst tabakayı aspire edin ve virüse TDS vektöründen M-cherry entegrasyonuna karşılık gelen yaygın kırmızı floresan gösteren plakları aramak için bir floresan mikroskobu kullanın. Hedef gene ve seçilen floresan etikete bağlı olarak, aynı kırmızı plağın içinde etiket geninin lokalize floresansı da gözlemlenebilir.

Şimdi, her rekombinant virüs için birden fazla plak seçin, pipet ucuyla kazıyın ve 100 µL %5 FBS içeren DMEM ile hücreleri bir Eppendorf tüpüne aktarın. Rekombinant virüslerin salınması için kazınan hücrelere üç döngü dondurma-çözdürme işlemi uygulayın.

Rekombinant virüsleri, büyüme ortamındaki GPT seleksiyon reaktifleri ile amplifiye etmek için, dondurulup çözülmüş virüs içeren DMEM'i 12 kuyucuklu bir plakadaki hücre monokatmanına ekleyin. Ardından, enfeksiyondan 24 saat sonra başarılı amplifikasyonları kazıyarak toplayın. Kırmızı floresan sergileyen, başarıyla amplifiye edilmiş plakların plak analizi için, altı kuyucuklu bir plağa BS-C-one hücrelerinden oluşan bir monokatman ekleyin.

Rekombinant virüslerin seri dilüsyonunu gerçekleştirin ve kuyucukları FBS içermeyen DMEM içindeki artan virüs dilüsyonları ile enfekte edin. Enfeksiyondan 1 saat sonra sıvı medyumu uzaklaştırın ve her kuyucuğun üzerine complete minimal essential medium içinde %0,5 agaroz ekleyin. Enfeksiyondan üç gün sonra, hem kırmızı hem de seçilen floresan etiketin renginde floresans gösteren plakları seçin.

Bunları GPT seçimi olmadan tekrar amplifiye edin. Yaygın kırmızı floresansı kaybetmiş ancak seçilen etikete karşılık gelen lokalize floresansı koruyan plakaları seçin. M-cherry ve GPT seçim genlerini kaybetmiş fakat seçilen etikete karşılık gelen lokalize floresansı koruyan rekombinant virüslerin saf bir stokunu elde etmek için seçim yapmadan plak temizleme işlemine devam edin.

Benzer plak fenotipine sahip plaklar elde etmeyi hedefleyerek, stokların saflığını bir plak deneyi ile değerlendirin. Test viral stoklarını bir BS-C-one hücre monokatmanında amplifiye edin. Enfeksiyondan 24 saat sonra, enfekte hücreleri 250 µL DMEM içerisine kazıyarak toplayın. Enfekte hücreleri santrifüjleyin, süpernatantı uzaklaştırın ve hücre peletini TE tamponundaki %0,1 SDS içeren 500 µL içerisinde yeniden süspande edin. Hücreleri liz etmek için vorteksleyin. Ardından 500 µL fenol, kloroform, izoamil alkol ekleyin ve karıştırmak için ters çevirin. Santrifüjleyin. Üst fazı toplayın ve ekstraksiyon işlemini tekrarlayın.

Ardından, DNA'yı sulu katmandan çöktürmek için bir mililitre soğutulmuş, %100 etanol ve 50 µL sodyum asetat ekleyin. Ters çevirerek karıştırın ve örneği -20 °C'de gece boyunca bekletin. DNA'yı santrifüjle çöktürdükten sonra tüm sıvıyı uzaklaştırın, DNA çökeleğini havada kurutun ve 50 µL TE tamponunda yeniden süspande edin. Viral insersiyon için PCR taraması yapmak amacıyla bu genomik DNA şablonunu kullanın. Metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı şekilde, çoklu etiketlere sahip rekombinant virüsler üretin.

Bu rekombinant vaccinia virüsleri, sırasıyla virüsün iç çekirdeğinin ve dış zarının parçaları olan A3 ve F13 viral yapısal proteinlerini hedefleyen, floresan markörlerle etiketlenmiş proteinler eksprese eder. Virüs partiküllerini görselleştirmek için virion lokalize proteinlere karşılık gelen genler seçilmiştir. A3, vaccinia virionunun bir çekirdek proteinidir ve F13 bir viral zar proteinidir.

Hem floresan işaretli A3 hem de F13 içeren çift etiketli bir virüs de gösterilmiştir. Çift etiketli bir virüs ile gerçek zamanlı floresan mikroskopisi gerçekleştirilebilir. Bu örnekte, vaccinia virüsünün iç çekirdek proteini A3 kırmızıya, dış zarf proteini F13 ise yeşile işaretlenmiştir.

Virüs fabrikasından çıkan paketlenmemiş virüs partikülleri kırmızı renkte görüntülenmiş olup, paketlenmiş viriyonlar kırmızı ve yeşil kanalların kolokalizasyonu ile temsil edilmiştir. Rekombinant vektörler ile vaccinia virüsü genomu arasındaki rekombinasyon verimliliklerini belirlemek için kantitatif analiz kullanılmıştır. Vektörlerin vaccinia virüsü genomu ile homolog rekombinasyon verimliliği, 70 baz çifti kadar düşük homoloji bölgeleri ile tespit edilebilmektedir.

Bu yöntem, çoklu floresan etiketlere ve/veya çoklu gen delesyonlarına sahip virüsler oluşturmak için kullanılmıştır. Bunlar, virüsün enfeksiyöz yaşam döngüsünün, viral proteinlerin konakçı savunma sistemlerini etkisiz hale getirmedeki rolünün ve konakçı sinyalizasyon süreçleriyle olan etkileşimlerin incelenmesinde kullanılmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, kullanılan etiketler bakımından modüler, istenen rekombinantların çözümlenmesi konusunda titiz ve çeşitli araştırma bağlamlarında uygulanabilir bir yöntem kullanarak rekombinant vaccinia virüslerinin nasıl üretileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmanız gerekir.