Kırmızı kan hücreleri üzerinde antikor kaynaklı kompleman aktivasyon sayısal tespiti için Yöntemler
29 Ocak 2014
Burada, kırmızı kan hücrelerine karşı antikorlar tarafından neden olunan kompleman aktivasyon ölçmek için iki tahlil tarif eder. Mevcut deneylerde üzerinde en büyük avantajı, nicel ve kolay yorumlamak doğasıdır.
Aşağıdaki deneyin genel amacı, hasta serumundaki kırmızı kan hücrelerine veya RBC'lere karşı antikorların kompleman aktivasyonunu değerlendirmektir. Bu, RBC yüzeyinde C, dört ve C3 birikimini indüklemek için bloke edici anti C beş antikoru varlığında kırmızı kan hücrelerinin hasta serumu ile inkübe edilmesiyle elde edilir. Daha sonra, RBC'ler floresan olarak işaretlenmiş anti C dört ve anti C3 antikorları ile boyanır ve RBC'ler üzerindeki kompleman birikimi miktarı daha sonra alternatif bir yöntemde akış sitometrisi ile analiz edilebilir.
RBC'ler, kompleman aracılı lizizi indüklemek için anti C beş yokluğunda hasta serumu ile inkübe edilir. Parçalanmış eritrositlerin yüzdesi daha sonra hücreler tarafından salınan hemoglobin miktarının spektrometri ile ölçülmesiyle belirlenebilir. Bu yeni tekniğin, rutin teşhiste kullanılan hemoliz veya antiglobulin testi gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, doğası gereği kantitatif olması ve kompleman aktivasyonundaki suboptimal farklılıkları tespit edebilmemizdir.
Laboratuvarımızdaki doktora sonrası Elizabeth Brook prosedürleri gösterecek: Sıfır tipli kırmızı kan hücrelerini PBS ile üç kez yıkayarak başlayın, daha sonra peleti% 0.5 Roma şeridi çözeltisinde% 0.5 Roma şerit çözeltisinde 37 santigrat derecede 10 dakika boyunca inkübe edin, hücreleri üç kez daha yıkadıktan sonra, akış sitometrisi ile RBC'ler üzerindeki kompleman birikimini analiz etmek için dört santigrat derecede taze PBS'de% 3'lük bir çözelti olarak saklayın. İlk olarak, serum ısıl işlem görürken istenen miktarda hasta serumunu 56 santigrat derecede 30 dakika boyunca inaktive edin. Son yıkamadan sonra brola ile muamele edilmiş kırmızı kan hücrelerini Roal tamponunda üç kez yıkayın.
Resus, peleti vbg plus plus'ta %0,5'lik bir seyreltmeyle askıya alır. Daha sonra bir cam incide 25 mikrolitre% 0.5 RBC'ler, 37.5 mikrolitre taze AB serumu ve mililitre başına 37.5 mikrolitre 200 mikrogram, 96 kuyulu yuvarlak bir alt plakanın her bir oyuğuna beş anti C. Daha sonra, ısıyla inaktive edilmiş hasta serumunu her bir oyuğa uygun konsantrasyonda ekleyin, gerektiği gibi ısıyla inaktive edilmiş AB serumu ile destekleyin ve ayrıca negatif bir kontrol de dahil edin.
Her bir oyuğu 150 mikrolitrelik nihai hacme getirmek için VBG plus plus kullanın ve daha sonra inkübasyondan sonra çalkalanarak 37 santigrat derecede bir buçuk ila iki saat boyunca E IA folyo ile kaplanmış plakayı inkübe edin. Hücreleri% 0.5 BSA ile takviye edilmiş PBS ile üç kez yıkayın ve ardından hücreleri mililitre başına bir mikrogram ile etiketleyin. Floresan etiketli bir anti C3 ve anti C dört monoklonal antikor, hücreleri oda sıcaklığında 30 ila 45 dakika boyunca hafifçe çalkalama ile inkübe eder ve daha sonra plakayı üç kez yıkadıktan sonra, RBC'leri 150 mikrolitre PBS ve% 0.5 BSA içinde yeniden süspanse eder.
Hücre süspansiyonlarını yeni bir 96 kuyucuklu yuvarlak alt plakaya iyi bir şekilde aktarın ve ardından plakayı akış sitometresine yükleyin, ileri bir saçılma grafiği kullanarak tek hücreleri çiftlerden ayırın. Kapıyı tek RBC'lere ayarlayın ve ardından floresan sinyalleri için uygun algılama kanalını seçin. Kantitatif hemolitik analiz için medyan floresan yoğunluğunu kullanarak sonuçları ölçün, hasta serumunu ısıtın ve aktive edin ve marul ile tedavi edilen RBC'leri az önce gösterildiği gibi yıkayın.
Daha sonra, RBC'leri az önce gösterildiği gibi kompleman ve hasta serumu ile inkübe ettikten sonra, ancak anti C beşi olmadan, hücreleri azaltılmış yavaşlama ile 664 GS'de beş dakika boyunca döndürün. Daha sonra, 90 mikrolitre süpernatanı dikkatlice yeni bir mikrotitre plakasına aktarın, sağlam hücreleri aktarmamaya ve hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçınmaya dikkat edin ve ardından bir spektrofotometre ekspresinde dört 14 ila altı 90'da emilimi ölçün. Saf suda inkübe edilmiş bir RBC numunesinin parçalanmasının bir yüzdesi olarak hemoliz.
Bu ilk şekilde, brola ile muamele edilmiş RBC'ler için temsili dağılım grafikleri, tek RBC'ler için uygun geçitin burada görülebileceği gösterilmiştir. Tipik olarak, RBC'lerin yaklaşık% 95'i bu tek hücre kapısı içinde yer alır. Bu histogramlarda otoimmün hemolitik anemi veya aha'nın etkisi için temsili sonuçlar.
C dört ve C3 birikiminde hasta serumu beklendiği gibi gösterilir, daha fazla hasta serumu daha fazla kompleman birikimine yol açar. İlginç bir şekilde, kompleman birikimi iki farklı pozitif zirvede meydana gelir. Bu muhtemelen RBC popülasyonundaki heterojenlikten kaynaklanmamaktadır, çünkü RBC'ler tek bir donörden alınmıştır, ancak bu fenomenin nedeni hala araştırılmaktadır, ancak numunelerin medyan floresan yoğunlukları bu çizgi grafiklerinde C dört ve C3 biriktirme testlerinin tekrarlanabilirliğini göstermek için çizilmiştir.
Çeşitli AH H hasta örneklerinin birikimindeki geniş varyasyona dikkat edin. Son olarak, RBC'lere karşı oto antikorlar içeren bir ahha hasta serum örneğinin hemolitik testinden elde edilen veriler bu grafiklerde gözlemlenebilir. Serum numunesi ile titrasyon, anti C beş gibi uygun bir kompleman inhibitörü ile net bir tekrarlanabilir eğri verir.
Hemolitik sinyal, bu grafikte gösterildiği gibi titre edilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, C3 veya C dört birikiminin akış sitometrik analizi veya kantitatif hemolitik test ile kırmızı kan hücresine özgü antikorlar tarafından kompleman aktivasyonunun nasıl ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, kırmızı kan hücrelerine (RBC'ler) karşı antikorların indüklediği kompleman aktivasyonunu ölçmek için kullanılan iki deneyi tanımlamaktadır. Nicel olan ve yorumlanması kolay olan bu deneyler, mevcut yöntemlere göre avantajlar sunmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- İmmünoloji
- Hematoloji
- Akış Sitometrisi
Arka Plan
- Kompleman aktivasyonu, bağışıklık yanıtlarında kritik bir öneme sahiptir.
- Alyuvarlara karşı gelişen antikorlar çeşitli klinik durumlara yol açabilir.
- Mevcut analizlerde kantitatif hassasiyet eksikliği olabilir.
- Yeni yöntemler, kompleman aktivasyonunun tespitini iyileştirmeyi amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Eritrositlere karşı antikorlar tarafından gerçekleştirilen kompleman aktivasyonunu değerlendirmek.
- Sonuçların daha iyi yorumlanabilmesi için kantitatif bir analiz yöntemi geliştirmek.
- Yeni teknikleri mevcut tanı yöntemleriyle karşılaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- RBC'lerin hasta serumu ve bloklayıcı antikorlarla inkübasyonu.
- RBC'lerin floresan işaretli antikorlarla boyanması.
- Kompleman birikiminin akış sitometrisi ile analizi.
- RBC lizisini belirlemek için hemoglobin salınımının ölçümü.
Ana Sonuçlar
- Yeni analizler, kompleman aktivasyonu hakkında kantitatif veriler sağlar.
- Aktivasyondaki optimal olmayan farklılıklar tespit edilebilir.
- Sonuçlar, geleneksel yöntemlere kıyasla artırılmış hassasiyet göstermektedir.
- Akış sitometrisi analizi, detaylı yorumlama imkanı sunar.
Sonuçlar
- Yeni analizler, kompleman aktivasyonunun anlaşılmasını geliştirmektedir.
- Mevcut tanı testlerine güvenilir bir alternatif sunmaktadırlar.
- Gelecekteki uygulamalar, hasta tanısını ve tedavisini iyileştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Kırmızı kan hücrelerinde antikorla indüklenen kompleman aktivasyonunun kantitatif değerlendirmesi, kompleman inhibitör etkinliğinin değerlendirilmesi ve otoimmün ile alloimmün bozukluklardaki hemolitik mekanizmaların anlaşılması açısından kritik öneme sahiptir. Açıklanan akış sitometrisi ve spektrofotometrik analizler, kompleman aktivasyonundaki suboptimal farkların tespitine olanak tanıyan tekrarlanabilir ve kantitatif sonuçlar sağlayarak, terapötik geliştirmedeki mekanistik risk azaltma süreçlerini destekler. Bu yöntemler, kalitatif gözlemleri preklinik ve klinik karar verme süreçleri için ölçülebilir ve aktarılabilir biyobelirteçlere dönüştürerek, hedef doğrulamadaki öngörüsel güveni artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: RBC'ler üzerinde otoantikorlar veya alloantikorlar tarafından indüklenen kompleman birikimini (C3/C4) nicelendirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Antikor aracılı efektör aktivitenin doğrudan ölçümü yoluyla fonksiyonel hedef doğrulaması sağlayarak hedef seçimindeki mekanistik belirsizliği azaltır.
- Öngörücü Değer: Kompleman aktivasyon potansiyeli hakkında nicel veriler üreterek portföy önceliklendirmesini destekler ve kompleman modüle eden terapötikler için karar verme süreçlerini (go/no-go) bilgilendirir.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Kompleman inhibitörlerinin veya terapötik antikorların yüksek kapasiteli taraması için uygun, standartlaştırılmış, kantitatif çıktılar (medyan floresans yoğunluğu, hemoglobin salınımı) üretir.
- Tekrarlanabilirlik: Hasta serum örnekleri arasında düşük değişkenlik göstererek, güvenilir bileşik değerlendirmesine ve laboratuvarlar arası standardizasyona olanak tanır.
- Platform Kullanışlılığı: Keşif süreçlerinde kompleman bağımlı biyolojik aktiviteyi ölçmek için yeniden kullanılabilir analizler oluşturmak amacıyla erişilebilir cihazlar (akış sitometresi, spektrofotometre) kullanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalık İlişkisi: Hedef etkileşimini fonksiyonel kompleman aktivasyonuna bağlayarak, otoimmün hemolitik anemi (AIHA) ve alloimmün hemolizdeki patofizyolojik mekanizmaları modeller.
- Translasyonel Süreklilik: Klinik hemolitik potansiyel ile korele olan kantitatif biyobelirteçler (C3/C4 depozisyonu, hemoliz) sağlayarak, keşif aşaması ile preklinik doğrulama arasında köprü kurar.
- Riskten Arındırılmış İlerleme: Kompleman aracılı lizisi nicelleştirerek mekanistik risklerin azaltılmasını sağlar; preklinik çalışmalarda güvenlik değerlendirmelerine ve doz-yanıt modellemesine veri sağlar.
İşlem Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu analizler, hedef doğrulamadan öncü bileşik tanımlamaya ve preklinik güvenlik değerlendirmesine kadar olan keşif sürecine entegre olarak, biyolojik risk azaltma ve terapötik indeks değerlendirmesine veri sağlayan kantitatif kompleman aktivasyon okumaları sunar.
- Keşif Biyolojisi: Antikorla tetiklenen kompleman aktivasyon yollarını nicelleştirerek hipotez testlerini destekler ve immünomodülatör adayların etki mekanizmasını aydınlatır.
- Tarama: Test bileşiklerinin veya serum örneklerinin güvenilir şekilde karşılaştırılmasına olanak tanıyan, analize hazır, kantitatif çıktılar (florasan yoğunluğu, spektrofotometrik hemoliz) sunar.
- Analitik: Doz-yanıt çalışmalarında istatistiksel analizi ve koşullar arası karşılaştırmayı kolaylaştıran ölçülebilir okumalar (medyan florasan yoğunluğu, hemoglobin salınımı) üretir.
- Translasyonel Araştırma: AIHA ve transfüzyon ortamlarında görülen kompleman aktivasyonunu yansıtan hastalıkla ilişkili çıktılar aracılığıyla preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Antikor terapötikleri, biyobenzerler ve kompleman inhibitörleri genelinde komplemana bağımlı aktiviteyi değerlendirmek için ölçeklenebilir ve standardize edilmiş bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Kalitatif kompleman analizlerini kantitatif ve aktarılabilir ölçümlere dönüştürerek hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: RBC hazırlama, serum inkübasyonu ve akış sitometrisi veya spektrometri yoluyla tespit için tanımlanmış protokoller aracılığıyla tekrarlanabilirliği ve standardizasyonu geliştirir.
- Stratejik Değer: Kompleman aktivasyonuna yol açan risklerin erken tespitini sağlayarak sermaye verimliliğini artırır ve immünomodülatör programlarda geç aşama başarısızlık riskini azaltır.
- Portföy Etkisi: Kompleman aktivasyon potansiyelini nicelleştirerek risk odaklı önceliklendirmeye veri sağlar ve terapötik geliştirme süreçlerinde objektif ilerleme kararlarını destekler.
Uygulama Hususları
- Kompleman birikimi ve hemoliz ölçümlerinin doğru şekilde gerçekleştirilebilmesi için immünoloji, akış sitometrisi ve spektrofotometrik analiz uygulamalarında uzmanlık gereklidir.
- Uygun floresan kanallara sahip akış sitometrelerine ve 414/690 nm'de hemoglobin miktar tayini için spektrofotometrelere erişime bağlıdır.
- Kullanıcılar ve merkezler arasında analiz tutarlılığını sağlamak için RBC hazırlığının (örneğin; sıfır tipi, bromelin işlem görmüş) ve serum ısı inaktivasyonunun standardizasyonu gereklidir.
- İnsan AB serumu dışındaki farklı RBC türlerine, antijen yoğunluklarına veya kompleman kaynaklarına uygulandığında adaptasyon değerlendirmeleri gerektirir.
- Pratik kısıtlamalar arasında, hemoliz miktar tayini doğruluğunu etkileyebilecek hücre taşınmasını ve hava kabarcıklarını önlemek için süpernatantın dikkatli transfer edilmesi gerekliliği yer alır.
