Sinir doku rejenerasyonu için Çözünür ve Çözünmeyen Biyotinile Proteinlerin ifade, izolasyon ve saflaştırılması

Bu prosedürün genel amacı, problar, sensörler, ilaç dağıtımı ve doku mühendisliği gibi çeşitli uygulamalara dahil edilebilen rekombinant biyotinillenmiş proteinleri başarılı bir şekilde tasarlamak, eksprese etmek ve izole etmektir. Bu, önce özel olarak tasarlanmış plazmitin küçük ölçekli kültürler kullanılarak bir bakteri konak hücre hattına dönüştürülmesi ve ardından hedef proteinin ekspresyonunun indüklenmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, uygun saflaştırma prosedürlerini formüle etmek için hedef proteinin varlığı ve çözünürlüğü belirlenir.

Daha sonra prosedür, hedef proteinin daha büyük verimlerini üretmek için ölçeklendirilir ve bunlar daha sonra afinite kromatografisi teknikleri kullanılarak izole edilir. Son olarak, proteinler saflaştırılır ve daha sonra sonraki uygulamalar ve analizler için konsantre edilir. Sonuç olarak, SDS sayfası ve FPLC sonuçları, rekombinant proteinlerin başarılı bir şekilde izole edildiğini ve saflaştırıldığını ve proteinlerin işlevsellik açısından daha fazla test edildiğini doğrular.

Rekombinant protein mühendisliğinin temel avantajı, tam bilimsel spesifikasyonlarımızı karşılamak için özel olarak tasarlanmış proteinlerin büyük ölçekli veya miligram ölçekli miktarlarını oluşturmamıza izin vermesidir. Örneğin, yeni özellikleri etkinleştirmek için bu proteinlerin bölümlerine yeni işlevler ekleyebiliriz. Bugün size belirli proteinlerin uçlarını nasıl biyotin yapabileceğinizi göstereceğiz ve bunu, nöronal büyüme veya nöronal farklılaşma gibi hücresel işlevlere rehberlik etmek için bu proteinleri yüzeylere özel olarak hareketsiz hale getirmek veya bağlamak için kullanıyoruz.

Bu tekniğe yeni başlayan kişiler, doğal veya doğal olmayan protein izolasyonu prosedürlerini takip ederken çok fazla zorluk çekmemelidir. Birçok adım aynıdır, ancak yerel veya yerel olmayan koşullar için formüle edilmiş özel arabellek gerektirir. Başlangıçta ayrıntılara dikkat edin.

Dönüşüm ve test ekspresyonu aşamaları, daha sonraki nihai ölçek büyütme işlemi sırasında yüksek protein verimi sağlayacaktır. Bu yöntemin görsel gösterimi önemlidir, çünkü rekombinant proteinlerin basit laboratuvar ekipmanı ve malzemeleri kullanılarak nasıl yapılabileceğini gösterir. Basit kesikli reaksiyon kullanılarak, e eşitleme ve büyüme ortamı, ana kültür başına 10 miligram protein üreterek lider ölçekte büyütülür.

Ek olarak, proteinlerin sonraki uygulama için nasıl daha fazla saflaştırıldığını göstermek için kromatografi teknikleri kullanılabilir ve gösterilebilir Bugün, Cinema Lab mezunu Alicia, ilgilenilen hedef proteinde ekspresyon için klonlama ve test ettikten ve gece boyunca 20 mililitrelik bir kültür büyüttükten sonra prosedürü gösterecek. Metin protokolüne göre, gece kültürünü ampisilin ile 1.8 litre steril büyüme ortamına dökün ve altı ila sekiz damla steril köpük önleyici 2 0 4 eklemek için bir macun pipeti kullanın, kültürleri 0.2 mikronluk bir filtreden 37 santigrat derece su banyosuna yerleştirin, havalandırma taşları aracılığıyla kültürlere basınçlı hava püskürtün. Kültür, bir milimolar IPTG'de 0.7 ila 0.8'lik bir OD 600'e ulaştığında ve proteinin test ifadesinde çözünür veya çözünmez fraksiyonda bulunup bulunmadığına bağlı olarak, 37 santigrat derecede dört saat veya gece boyunca 18 santigrat derecede indükleyin.

Hücreleri toplamak, kültürü bir litrelik santrifüj şişelerine aktarmak ve 14.000 kez yerçekimi ve dört santigrat derecede 15 dakika döndürmek için deneyler. Süper natini dökün ve ince bir spatula kullanarak bakteri peletini 50 mililitrelik iki tüpe alın. Peletleri eksi 80 santigrat derecede saklamadan önce birkaç dakika santrifüjleme ile hücreleri tekrar peletleyin.

Doğal olmayan proteini gerçekleştirmek için. Her donmuş e coli peletine çözünmeyen bir protein için izolasyon. 20 mililitre lizis, yıkama tamponu ve girdap ekleyin ve büyük parçaları ortadan kaldırmak için yeniden askıya almak için sallayın.

Gece boyunca bir mutatör üzerinde inkübe edildikten sonra, çözelti viskoz bir bulamaç santrifüjü gibi görünecektir. Bulamaç, 20, 500 kez yerçekimi ve oda sıcaklığında 30 dakika. Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve doğal protein izolasyonu için peleti atın.

Resus, peletleri lizis tamponunda 30 mililitrelik bir son hacimde askıya alır ve buz üzerinde yeniden askıya alınmış pelet ile süspanse eder. Sonicate'i 30 saniye kapalı 30 saniyelik bir nabız ile% 30 genliğe ayarlayın ve beş dakika boyunca sonikasyon yapın. Hücre peletini tamamen parçalamak için sonikasyon sırasında tüpü yukarı ve aşağı sallayın.

Bulamacı 30 dakika boyunca 20, 500 kez yerçekimi ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Ardından süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve peleti atın. Doğal olmayan izole edilmiş bir protein üzerinde afinite kromatografisi yapmak için, her santrifüj tüpüne bir mililitre nikel NTA reçine çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında bir mutatör veya çalkalayıcı üzerinde en az bir saat inkübe edin.

Bulamacı bir afinite kolonuna dökün ve çözeltinin stop musluğu valfinden tamamen bir atık kabına damlamasına izin verin. Artık reçineyi çıkarmak için santrifüj tüpüne 10 mililitre yıkama tamponu ekleyin ve çözelti damladıktan sonra çözeltiyi kolona ekleyin. Reçineyi karıştırmak için bir cam karıştırma çubuğu kullanın ve başka bir yıkama eklemeden önce damlamasını bitirmesine izin verin.

Daha sonra, santrifüj tüpünün durulamasını tekrarlamak ve kolona aktarmak için 10 mililitre yıkama tamponu kullanın. Ardından, her yıkama için 10 mililitre lizis yıkama tamponu ile kolonun sekiz yıkamasını daha gerçekleştirin. Yıkamalar tamamlandıktan sonra, durdurma musluğunu kapatın ve atık kabı 50 mililitrelik santrifüj tüpü ile değiştirin.

Kolona 15 mililitre elucian tamponu ekleyin, reçineyi karıştırın ve çözeltinin beş dakika bekletilmesine izin verin. Daha sonra durdurma musluğunu açın ve doğal bir proteini saflaştırmak için ek 15 mililitre elüsyon tamponu ile tekrarlamadan önce EIT'yi toplayın. Nikel NTA reçinesini protein çözeltisine ekledikten sonra, en az bir saat boyunca dört santigrat derecede bir mutatör üzerinde inkübe edildi.

Sütunu 10 kez yıkamak için yıkama tamponunu kullandıktan sonra, beş mililitre elüsyon tamponu ekleyin ve EIT kolondan damlarken EIT'nin çoğunu toplamak için yeni bir tüp kullanmadan önce reçineyi beş dakika inkübe edin, 90 mikrolitre Bradford reaktifinin oyuğu başına 96 oyuklu bir plakaya. Tamponlu her beş mililitre elusiyenden sonra, 10 mikrolitre çözeltinin kolondan 90 mikrolitre Bradford reaktifi içeren bir kuyuya damlamasına izin verin. Diyalize ve/veya Rena'ya protein artık tespit edilmeyene kadar AEB ile devam edin.

Proteinler, her bir EIT'yi diyaliz tüpüne aktarır ve ilgili tamponla değiştirilmeden önce dört santigrat derecede dört saat boyunca uygun tampona karşı diyalize edilir. Dört santigrat derecede iki gece. Diyalize edilmiş proteinleri beş mililitreden daha azına konsantre etmek için spin yoğunlaştırıcıları kullanın ve istenirse atin sekiz ile boyut dışlama kromatografisi kullanarak daha da saflaştırın.

Test ifadesi sırasındaki metin protokolüne göre, NGF ve SE üç A ilk olarak 37 santigrat derecede dört saat boyunca indüklendi ve SDS sayfa analizi, her iki proteinin de bu çözünür fraksiyonda bulunduğunu belirledi. Protein ekspresyonu adil görünüyordu ve bu nedenle 18 santigrat derecede gece boyunca indüksiyon ile başka bir test ifadesi incelendi. Çözünür fraksiyonda NGF ekspresyonu iyileşirken, SEMA üç ile gözle görülür bir fark yoktu.

Bir NGF, doğal ve yerel olmayan koşullar altında izole edildi ve saflaştırma için FPLC kolonundan geçirildi. NGF, test ifadesi sırasında çözünür fraksiyonda olmasına rağmen, doğal izolasyon hem 37 santigrat derece hem de 18 santigrat derece indüksiyonlarında düşük bir verim üretti. Bununla birlikte, yeniden natürasyon ile doğal olmayan izolasyon yoluyla daha yüksek bir NGF verimi elde edildi.

Sonuç olarak, NGF doğal olmayan koşullar altında izole edildi. 18 santigrat derecede gece boyunca indüksiyondan sonra, doğal olmayan izolasyon, doğal izolasyon için iki litrelik ana kültür başına 8.61 artı veya eksi 3.1 miligram olan bir üretim olan SEMA üç ile sonuçlanmadı. Bu nedenle, SEMA üç A, 37 santigrat derecede dört saat boyunca indüklendi ve doğal izolasyon parametreleri kullanılarak izole edildi.

FPLC pikleri toplandı ve NGF ve SEMA üç A örneği SDS sayfası ile analiz edildi. SEMA üç A için FPLC çıkışında bulunan ek protein pikleri toplandı ve SDS sayfası ile analiz edildi ve SEMA üç a moleküler ağırlık bölgesinde yer almadı. Bu fraksiyonlar büyük olasılıkla bozunma ürünleridir, çünkü SEMA üçünün yaptığı gibi hücre bazlı tahlillerde işlevsel olarak davranmamışlardır.

Burada belirtilen bir zirve. Rekombinant protein oluşturulduktan ve ustalaştıktan sonra, izolasyon ve saflaştırma, uygun şekilde yapılırsa sadece birkaç gün sürmelidir. Bununla birlikte, protein çözünürlüğünü doğru bir şekilde tanımlamak için ilk bakteri dönüşümü ve test ifadesi aşamaları daha uzun sürer.

Çözünürlük belirlendikten sonra, dönüştürülmüş bakterilerin bir kütüphanesi eksi 80'de saklanabilir. Ek olarak, protein ekspresyonundan sonra, e coli peletleri daha fazla izolasyon ve deneye kadar eksi 80'de de saklanabilir. Bu prosedürü denerken, proteazların proteinlerinizi denatüre etmesini ve parçalamasını önlemek için tamponların sterilize edildiğinden ve taze hale getirildiğinden emin olmak önemlidir.

İzolasyon tamponları her dört ila altı haftada bir yapılmalı ve sterilize edilmeli ve diyaliz tamponları izolasyondan bir gün önce yapılmalıdır. N-I-N-T-A ve FPLC kolonları, birden fazla biyotinile proteinden çapraz kontaminasyonu önlemek için üreticinin protokollerine göre temiz olmalıdır. Bu videoyu izledikten sonra, bir bakteri konak ekspresyon sistemi kullanarak özel olarak tasarlanmış biyotinile proteinlerin nasıl eksprese edileceğini, izole edileceğini ve saflaştırılacağını iyi anlamış olmalısınız.

Bu, hem bilimsel hem de ticari olarak küçük ve büyük ölçekte yapılanlara benzer. Bu nedenle, bunun geniş bir uygulaması vardır.