Gelişmekte Embriyonik Fare Kalp Vana Bölgesi'nde Protein İzolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, embriyonik kalp kapakçıklarından proteini izole etmek ve çıkarmaktır. Bu, önce hamile bir fareden bir embriyonun izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, kalp embriyodan diseke edilir ve daha sonra son aşamada kalp kapakçıkları toplanır.

Doku parçalanır ve elde edilen protein örneği sonraki analizler için hazırlanır. Sonuç olarak, protein ekspresyon seviyelerini değerlendirmek için batı BLO analizi kullanılabilir. Bu yöntemin görsel gösterimi, gelişmekte olan kalbin küçük kompakt şekli nedeniyle diseksiyon adımlarının öğrenilmesi zor olduğu için kritik

İstenilen embriyonik gelişim gününde, hamile kadının karnını sterilize etmek için% 70 etanol kullanın. Daha sonra alt karın bölgesinin derisini ve kasını yukarı kaldırın ve iç organlardan uzaklaştırın ve uterus boynuzuna erişim sağlamak için alt karın boşluğunu inceleyin. Daha sonra, rahim ağzını forseps ile tutun ve uçlara dikkatlice coddle kesin.

Daha sonra boynuzu yerinde tutan herhangi bir bağ dokusunu keserek rahim boynuzunu kaldırın ve rahim boynuzunun uct ile birleşim yerini keserek çıkarma işlemini tamamlayın. Diseke uterus boynuzunu soğuk 0.1 molar tris tamponu içeren bir Petri kabına yerleştirin ve gerektiği gibi durulayın. Sonra rahim boynuzunu kesin.

Embriyonik keseleri ortaya çıkarmak için uzunlamasına açın. Bir embriyoyu ortaya çıkarmak için, plasenta ve embriyonun birleştiği yerde bir embriyonik torba kesin ve embriyoyu serbest bırakmak için göbek damarlarını kesin. Diseke edilmiş embriyoyu soğuk 0.1 molar tris tamponu olan ikinci bir Petri kabına yerleştirin ve ilk Petri kabını kalan ve disseke edilmiş embriyolarla birlikte bir sonraki embriyonik diseksiyona kadar buza geri koyun.

Dekapitasyondan sonra, embriyoyu sırt üstü yerleştirin ve göğüs duvarını göğüs kafesinin kenarı boyunca dikey olarak, topallama için a'ya yakın ve diyaframın üzerinde yatay olarak kesin. Kalbi görselleştirmek için göğüs duvarını açın. Sonra forsepsleri büyük damarlar boyunca yukarıda tutun, kalbi kaldırın ve aşağıdaki damarları kesin.

Sonra, kalbi serbest bırakmak için forsepsin üzerini kesin. Pulmoner damarlar kesilmeden kalırsa, burada açıklanan embriyonik aşamalara devam etmeden önce kalple birlikte akciğerleri çıkarın, pulmoner arter hafif opaktır. Arteri tanımladıktan sonra, kapak seviyesinin üzerinde kesin ve çıkarın.

Şimdi, ECD ventriküler miyokarddan kaçınarak pulmoner kapağın hemen altından kesin ve fazla tris tamponunu ilgilenilen bölgeden uzaklaştırın. Valfi, pulmoner arter gibi iki mikrolitre lizis tamponu içeren bir einor tüpüne yerleştirmeden önce, aort hafif opak görünecektir. Tanımlandıktan sonra, aort kapağının hemen altından kesin.

Yine, trabeküle ventriküler miyokarddan kaçınmak. Fazla tri çözeltisini çıkarın ve ardından valfi lizis, tampon ve pulmoner arter dokusu içeren einor tüpüne aktarın. Dokunun tamamı toplandıktan sonra, numuneleri hemen eksi 80 santigrat dereceye kadar yerleştirin.

Protein ekstraksiyonu için kullanın, toplanan dokuları buz üzerinde çözdürün ve ardından numuneleri dört santigrat derecede 13, 100 Gs'de bir dakika boyunca peletleyin. Elde edilen numunenin hacmini kontrol edin ve toplam hacmi 40 mikrolitreye çıkarmak için lizis tamponu kullanın. Ardından, üreticinin talimatlarına göre 50 hertz'de iki ila dört dakika boyunca bir lyr'deki numuneleri parçalamak ve homojenize etmek için beş milimetre paslanmaz çelik boncuk ekleyin.

Homojenizasyondan sonra, tüpleri kısa bir süre döndürün ve numuneleri yeni tüplere aktarın ve daha fazla deneysel analiz için çözünmeyen kalıntıları geride bırakın. Bu hazırlama tekniği kullanılarak, E 13.5 embriyolarından tek aort kapak bölgelerinde fosforile smad 1 5 8 tespit edilebilir. Örneğin, tek bir kapak bölgesinden bile izole edilen protein, bir araya getirilen valf bölgelerinin sayısıyla orantılı olarak artan sinyal yoğunluğu ile soluk bir p smad bandını tespit etmek için yeterlidir.

Daha da önemlisi, p smad beta aktin oranı, mevcut düşük protein seviyeleri nedeniyle farklı numune boyutlarında açıkça sabit kalır, aynı leke sıyrılamaz ve toplam smad için yeniden incelenemez. Bununla birlikte, toplam smad bir ve beta aktini gösteren ayrı bir leke aynı ifade modelini sergiler. Bu kapak bölgeleri, sağ ventrikülden alınan örneklerle kombinasyon halinde bu hazırlama tekniği kullanılarak ventriküler miyokardın kontamine edilmesinden neredeyse tamamen yoksundur, ventriküler miyokard markörü, aort kapak bölgelerinde bir NP tespit edilemezken, bu belirteç ventrikülde kolayca tespit edilir.

Ayrıca, ventriküler miyokardiyal belirteç miyozin hafif zincir iki V de ventriküler örnekte kolayca tespit edilebilir, ancak aort kapak bölgelerinde zar zor tespit edilebilir, bu diseksiyonu takiben diseksiyonun kesinliğini vurgulamaktadır. QPCR veya RN AIC gibi diğer me'ler, farklı gelişim adımları sırasında hangi alt genlerin etkilendiği gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir.