Methyltransferases ve Kofaktör Analoglarının ile Nükleik Asitler ve Proteinler Dizi-spesifik Etiketleme

Aşağıdaki deneylerin genel amacı, aktive edilmiş metil grubunu ve aome adı verilen Şile l metiyonin kofaktörünü D-N-A-R-N-A'ya doğal olarak aktaran metil transferazları kullanarak DNA ve proteinleri spesifik olarak etiketlemektir. Proteinler veya küçük biyomoleküller. Bir aşamalı etiketleme, atlanan doğal kofaktörün, tüm kofaktörün enzimatik bağlanmasına yol açan reaksiyonun seyrini değiştiren sentetik aine kofaktörleri ile değiştirilmesiyle elde edilir ve bu nedenle substrat dizisinin kovalent etiketlenmesi DNA'nın spesifik metil transferaz ile indüklenen etiketlemesi, adine özgü DNA metil transferazı, MBSEC olanı ile gösterilir, biyotinile edilmiş Aine kofaktörü altı BAZ'ı, diziye yol açan AGCGAT tanıma dizisine birleştiren, spesifik olarak biyotinillenmiş, aktive edilmiş grupların DNA metil transferaz yönelimli transferi, etiket proteininin kullanımıdır ve MTA'ların set yedi dokuz, bir pro pargo grubunu C sekiz oin'den histon H üçünün lizin dördüne aktaran.

Alkillenmiş lizin kalıntısı, bakır katalizli tıklama kimyası kullanılarak azi modifiye edilmiş bir Fluor ile kimyasal olarak etiketlenir, böylece özel olarak etiketlenmiş proteine yol açar. Etiketleme için metamfetamin transferazları kullanmanın bir avantajı, doğal substratları doğrudan hedefleme potansiyeline sahip olmalarıdır. Bunu, plazmidin diziye özgü bioTE elasyonu, DNA Metamfetamin transferazı, kofaktör analog zin ile katalize protein modifikasyonu ile göstereceğim ve iki adımda çok çeşitli raportör gruplarının tanıtılmasını sağlayacağım.

Bunu, hisone H üç proteininin floresan etiketlemesi ve H üçünün biotin ile etiketlenmesinden elde edilen sonuçları göstererek göstereceğim. Ek olarak, çift aktif kofaktör çalışma analogları, çeşitli aktive alkoller ile metil grubu transferinden sonra kofaktör ürünü olan S ail, el homosistein yüklenerek kolayca sentezlenebilir. Sentetik kofaktör analogları, ters faz HPLC ile saflaştırılır ve bazı durumlarda epi Mars'ı kükürtte ayırmak bile mümkündür.

Gülümseyen DNA, DNA'nın diziye özgü metil transferaz ile indüklenen bir etiketlemesidir. Burada kavram, PB 3 22 plazmit DNA'nın altı BAZ Aine kofaktörü ve adine spesifik DNA metil transferaz ile etiketlenmesiyle gösterilmiştir. M-B-S-E-C, altı BAZ'ı 20 santigrat derecede tırmalayarak başlar.

Düşündükten sonra, reaksiyon karışımını buz üzerinde onarın. Bir mikrogram plazmit, 60 mikromolar altı BAZ ve 10 eşdeğer M-B-S-E-C içerir. Modifikasyon tamponundaki DNA üzerindeki HER tanıma dizisi.

Altı BAZ ve M-B-S-E-C'yi son olarak eklediğinizden emin olun. Kullanmakta olduğunuz metamfetamin transferazına bağlı AME olmadığından emin olun, çünkü doğal kofaktör etiketlemeyi engelleyecektir. React Kontroller için.

Spesifik olmayan kofaktör modifikasyonlarını görselleştirmek için MTA'ları suyla değiştirin ve enzim konsantresindeki doğal kofaktörü test etmek için kofaktör yerine su ekleyin. Şimdi reaksiyonları bir pipetle nazikçe karıştırın ve bir saat boyunca 55 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyonun sonuna doğru, 10 mikrolitre 10 x rekombinant tach, 80 mikrolitre suya bir tampon ekleyerek ve ardından 3.3 mikrolitre rekombinant tak bir kısıtlama endonükleaz ekleyerek buz üzerinde bir endonükleaz karışımını onarın.

İnkübasyondan sonra, reaksiyonları hızlı bir döndürme ile çekin ve ardından her birine DNA modifikasyonunu doğrulayın. İki mikrolitre 10 x tak, bir tampon ve 28 mikrolitre endonükleaz karışımı ekleyin. Reaksiyonları nazik pipetleme ile karıştırın.

Şimdi reaksiyonları yarım saat boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin. Reaksiyonlar tamamlandığında, çözeltiyi hızlı bir dönüşle çekin ve reaksiyonların 25 mikrolitresini yeni tüplere toplayın. Bu alikotlara, strept adin monomeri başına bir milimolar tamponlu 2.4 mikrolitre strep TTR ekleyin.

Şimdi bu reaksiyonu 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, tamamlanan reaksiyonlara beş mikrolitre altı x yükleme tamponu ekleyin ve yaklaşık bir saat boyunca 80 voltta% 1'lik bir agros jeli üzerinde 10 mikrolitre boşaltın. Daha sonra bantları görselleştirin, mt A, aktive edilmiş grupların metil transferaz yönelimli transferinin kısaltmasıdır.

Bu gösteride, metil transferaz yedi, dokuz ve çift aktive edilmiş kofaktör C sekizini ayarladı. Yolun, histon H'nin üçünün lizin dördünü etiketlemek için kullanılır. Bileşenlerin buz onarımı 20 mikrolitre reaksiyon karışımları üzerinde çözülmesinden sonra, tahlil çözeltisi modifikasyon tamponu 10 mikromolar histon H üç içerir ve son 10 mikromolar metil transferaz artı 600 mikromolar kofaktör eklenir.

C eight ON yerine deiyonize su koyarak bir enzim kontrolü yapın. Ayrıca, sentetik kofaktörlerle rekabet etmek için bir araya gelen 60 milimolar ADO'yu dahil ederek spesifik olmayan modifikasyonları görselleştirmek için bir kofaktör kontrolü yapın. Şimdi reaksiyonları yavaş boru zararlısı ile karıştırın ve pH'larını test şeritleri ile kontrol edin. Çift aktif kofaktör analogları C koşulları altında saklanır.

Bu nedenle, reaksiyon çözeltinizin pH'ı, pH'ı ayarlamak için gerekirse küçük miktarlarda 50 milimolar sodyum hidroksit eklenerek kofaktör eklenerek değiştirilebilir. Şimdi inkübasyon onarımı sırasında reaksiyonları iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçka bitmeden hemen önce% 12'lik bir SDS poli akrilamid jel, üç mili molar bakır sülfat, üç mili molar T-H-P-T-A ligand 250 milimolar, sodyum ACO yemi ve altı milimolar Tamara azid içeren 20 mikrolitre beş x tıklama karışımı yapın.

İnkübasyonun sonunda, her reaksiyona beş mikrolitre tıklama karışımı ekleyin ve reaksiyonları sevişme başına yavaşça karıştırın. Reaksiyonları folyo kullanarak ışıktan koruyun ve bir saat boyunca 20 santigrat derecede inkübe edin. Bir saat sonra, proteinleri çökelterek fazla kloroformu çıkarın.

Her reaksiyona 75 mikrolitre metanol, 18.7 mikrolitre kloroform ve 50 mikrolitre su ekleyin ve her eklemeden sonra kısa bir süre girdaplayın. Her tüpü hazırladıktan sonra, beş dakika boyunca 16.000 G'de döndürün. Proteinleri içeren arayüz katmanını bozmadan ayırmanın üst fazını çıkarın.

Şimdi 56.3 mikrolitre metanol, alt faz ve girdap ekleyin. Ardından, proteini peletlemek için bunu aşağı çevirin ve supinatı atın. Sonra 56.3 mikrolitre metanol ekleyin.

Yine, girdap. Sıkma işlemini tekrarlayın ve peletleri geri kazanın. Peletlerin tüplerinde, kapaksız ve tüy bırakmayan kağıtla kaplanmış olarak kurumaya bırakın.

Daha sonra proteinleri 20 mikrolitre SDS yükleme tamponunda yükleme boyası ile çözün. Peleti toplamak için tüp duvarlarını tamponla durulayın. Daha sonra tüpleri 95 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin.

Tüpler oda sıcaklığına çağrıldıktan sonra, içeriklerini çekmek ve proteinleri SDS sayfasına göre görselleştirmek için kısa bir süre harcayın. Yaklaşık 90 dakika boyunca 120 voltta çalıştırın. Gülümseme reaksiyonu, çift sarmallı A-T-C-G-A-T dizisi içindeki ikinci adenin kalıntısını modifiye eden ve PBR 3 2 2 plazmidi üzerinde bir tanıma bölgesine sahip olan DNA metil transferaz M-B-S-E-C ile gerçekleştirildi, plazmit etiketlemesini test etmek için kırmızı ile işaretlenmiştir.

PB 3 2 2'ye, PB 3 22'de yeşil renkle işaretlenmiş yedi bölgeye sahip olan ve biri M-B-S-E-C bir bölgeye dahil olan rekombinant kısıtlama ENDONUCLEASE T one ile itiraz edildi. Etiketleme gerçekleştiğinde, bu bölge jeldeki bölünmeye karşı korunmalıdır. Bu doğrulandı.

683 baz çifti içeren yeni bir parça ortaya çıktı ve M-B-S-E-C bir bölgede etiketleme olduğunu gösterdi. Bu sadece üçüncü şerit olan tahlil şeridinde görülür. Etiketleme reaksiyonunun özgüllüğü elektromobilite kayması ile gösterildi.

Strept adin ilavesi üzerine, biyotin ile etiketlenmiş 683 baz çifti fragmanının elektromobilitesi geciktirildi. M-B-S-E-C olmadan fragmanların hareketliliği değişmemiş iken veya çift aktive edilmiş sekiz oh met analogu ile metil transferaz substratlarının iki aşamalı bir etiketlemesi. Histon H üç lizin dört, metil transferaz seti yedi dokuz ve küçük C sekiz ON kofaktörü kullanıldı.

Floresan tespiti için sadece tahlil şeridinde jel elektroforezi kullanıldı. Birinci şerit, histon H'ye karşılık gelen bir floresan bant gösterdi, bu da kofaktörün yan zincirinin spesifik olarak aktarıldığını ve modifiye edilmiş proteinin Tamara Flora.Four ile etiketlendiğini gösterdi. ESI boyası bir yükleme kontrolü görevi görür.

Tüm şeritler aynı miktarda protein gösterdi. Metil transferaz substratları, azi'den türetilmiş bir biyotin ile biyotin reaksiyonları ile de etiketlenebilir. Bir Fluor yerine, yaban turpu peroksidaz ile Western blotlama ile test edildi.

Bu videoyu izledikten sonra konjuge Aden'in başarılı ve spesifik etiketlemesi görüldü. DNA ve protein dizisinin, özellikle afinite metni, Fluor kuvveti veya diğer etiketlerle nasıl etiketleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürü denerken, diğer met ve analoglarının sıcaklığa duyarlı olduğunu hatırlamak önemlidir.

Onları her zaman buz üzerinde tutun ve eksi 20 santigrat derecede saklayın. Sentezlenmiş çift aktif. Muhabir grubuyla birlikte diğer MET analogları zaten yan zincire yerleştirilmiştir ve bunları bir adımda DNA'yı spesifik olarak etiketlemek için kullanmıştır.

Tek molekül teknikleri kullanarak DNA haritalaması için farklı enzimleri ve rapor gruplarını birleştirme olasılığı beni özellikle heyecanlandırıyor. Gülümseme ve NEC çok esnektir ve hemen hemen her kimyasal grup sadece DNA ve proteinlere değil, aynı zamanda uygun meth transferleri kullanılarak RNA'ya ve küçüklere de aktarılabilir.