Kemokin Sinyalizasyonu Bağlı Hücresel ve Moleküler Polarizasyon Hızlı ve Sağlam Analizi

Aşağıdaki prosedürün amacı, belirli bir uyarana yanıt olarak hücre morfolojisindeki değişiklikleri ve çok sayıda hücrede ilgilenilen spesifik proteinlerin hücre altı lokalizasyonunu hızlı ve otomatik olarak ölçmektir. Bu, ilk olarak T hücrelerinin kemoterapi türleri ile uyarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, hücreler floresan olarak etiketlenir ve daha sonra görüntüleme akış sitometrisi ile analiz edilir.

Son adımda, morfolojik olarak polarize lenfositlerin sayısı ve floresan belirteçlerin ayrılma miktarı, seçilen maskeye bağlı olarak her boyama için piksellerin konumuna ve yoğunluğuna göre değerlendirilebilir. Sonuç olarak, bu görüntüleme akışı sitometrisi teknolojisi, kemokin stimülasyonundan sonra lenfositlerin morfolojik değişikliklerini ve ayrıca polarize hücreler içindeki ilgilenilen spesifik proteinlerin konumunu hızlı ve sağlam bir şekilde ölçmek için kullanılabilir. Bu tekniğin mikroskopi gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, çok sayıda hücrenin tekrar tekrar işlenebilmesi ve otomatik olarak analiz edilebilmesi, morfolojik değişikliklerin ve protein dağılımının istatistiksel olarak güçlü bir şekilde analiz edilmesini sağlamasıdır.

Kemokin ile uyarılmış T lenfositlerde, T hücrelerinin Boche tipi stimülasyonu, oda sıcaklığında 340 kez beş dakika boyunca 10 milimolar HEP santrifüjü ile desteklenmiş ılık HBSS'G.At de deney koşulu başına beş hücreyi beş kez merkezleyerek başlar, supinatı çıkarın ve peletleri tüp başına 0.3 mililitre ılık HBSS he parçasında yeniden süspanse edin. Daha sonra hücre süspansiyonlarını ayrı ayrı 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarın. Her tüpe mililitre kemokin başına 10 ila 500 nanogram ekleyin ve ardından karıştırmak için tüpleri birkaç kez çevirin.

Hücreleri 37 santigrat derece su banyosunda inkübe edin. Sekiz ila 10 dakika sonra, 10 milimolar ile desteklenmiş 0,3 mililitre ılık,% 2 paraldehit ile polarizasyonu durdurun. O bezelye.

Daha sonra tüpleri daha fazla çevirme ile karıştırın ve immünofloresan analizi için hücreleri boyamak için 37 santigrat derecede beş dakika daha inkübe edin. Daha sonra, uyarılmış T hücrelerini karşılık gelen akış sitometri tüplerine aktarın. Tüpleri tamamen boyama tamponu ile doldurun.

Daha sonra hücreleri döndürün ve peletleri PBS'de 100 mikrolitre% 5 fetal buzağı serumunda yeniden süspanse edin. Şimdi her tüpe beş mikrolitre ZI N-T-H-L-A-A-B-C ekleyin. Onları vorteksleyin ve inkübasyonun sonunda hücreleri karanlıkta 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.

Hücreleri iki kez yıkayın ve ardından 500 mikrolitre% 1 para formaldehit içinde inkübe edin. 10 dakika sonra, hücreleri daha fazla boyama tamponunda yıkayın ve ardından tüpleri tamamen geçirgenlik tamponu ile doldurun. Hücreleri geçirgenlik tamponunda iki kez yıkadıktan sonra, supinatı çıkarmak için tüpleri terk edin ve daha sonra hücre peletlerini ayırmak için bunları girdaplayın.

Şimdi numuneleri mililitre başına sıfır noktası 25 mikrogram, bel için trixi ile boyayın, girdaplayın ve karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Daha sonra inkübasyon süresinin sonunda, hücreleri geçirgenlik tamponunda yıkayın. Yine, resus.

Peletleri 200 mikrolitre PBS'de askıya alın ve daha sonra kemokin stimülasyonundan sonra polarize T hücrelerinin yüzdesini belirlemek için hücreleri ayrı mikro santrifüj tüplerine aktarın. Önce görüntüleme akış sitometresini açın ve üreticinin talimatlarına göre kendini kalibre etmesine izin verin. RMS gradyanında seçilen odak içi popülasyondan RMS gradyan değerlerini ölçen histogramlar çizin.

Histogram, mikro santrifüj tüpü makineye yerleştirildikten sonra alanın histogramında tek hücre popülasyonunu tanımlar, tek tek hücreler üzerinde lazer güç yürüyüşünü ayarlar ve 5.000 T lenfosit elde eder. Fikir analizi yazılımında. Alınan dosyaları açın, ardından her bir hücre için elde edilen parlak alan görüntüleri için gradyan RMS değerini gösteren bir histogram oluşturun, hücrelerin üzerine bir geçit çizin ve 57'nin üzerinde bir RMS gradyan değeri sergileyin.

Analiz menüsünde, iki pikselden aşınmış parlak alan görüntülerindeki morfoloji maskesinden M1 ikisini aşındırmak adlı yeni bir maske oluşturun. Daha sonra analiz özellikleri menüsünde, önceki kapıda oluşturulan hücrelerden erode M1 iki maskesi üzerinde hesaplanan alanın yeni bir özelliğini oluşturun. Hücrelerin alanını gösteren bir histogram açın Bu yeni oluşturulan maskeyi kullanarak, küçük alandaki kalibrasyon boncukları ve kalıntıların yanı sıra geniş alandaki çiftler hariç, tek tek T hücrelerinin üzerine bir kapı çizin.

Daha sonra a. botu açın. H-L-A-A-B-C boyamasındaki ham maksimum pikselin bir fonksiyonu olarak Phin boyamasındaki ham maksimum pikselin bir fonksiyonu olarak analiz maskeleri menüsünde yeni maskeye geri aşındırma adı verilen yeni maskeye iki tane H-L-A-A-B-C boyama hücrelerinin morfoloji maskesinden iki pikselden aşınmış. Daha sonra analiz özellikleri menüsünde, erode M iki iki üzerinde hesaplanan dairesellik parametresinden oluşan yeni bir özellik oluşturun.

Ardından, daha önce kapılı hücrelerden dairesellik özelliğinin değerlerini raporlamak için başka bir histogram oluşturun. Daha sonra, uyarılmamış hücreler için histogramın şekline bakıldığında, polarize hücreler için RO akik, en düşük dairesellik değerinden başlayarak, uyarılmamış hücrelerin çoğunun hücreler içindeki aktin lekelenmesinin polarizasyonunu değerlendirmek için çizildiği dairesellik sınır değerine kadar. Ayrıca parlak detay benzerliği için bir histogram, H-L-A-A-B-C ve boyamadaki foid'i karşılaştırmak için R üç değeri.

Daha sonra, az önce gösterildiği gibi aynı geçit stratejisini, ayrıca kolokalize olmayan ayrılmış boyama için uyarılmamış hücreler üzerinde bir GA kullanarak. İstatistik paneli, burada polarize aktin boyaması olan T hücrelerinin yüzdesini gösterir. Polarize olmayan veya polarize hücrelerin kapısına düşen CCL 19 ile uyarılmış T lenfositlerinin örnekleri gösterilmiştir.

Her iki alt popülasyon arasındaki morfolojideki farklılıklar açıkça gözlemlenebilir. Az önce gösterilen geçit stratejisi, CCL 19'un yokluğunda polarize kapıya düşen hücrelerin yüzdesini çizmek için de kullanılabilir. Beklendiği gibi, kemokin stimülasyonunun polarize T hücrelerinin yüzdesini arttırdığı açıktır.

Her iki koşul altında elde edilen tüm hücre popülasyonunun ortalama dairesellik indeksi de çizilebilir. Gerçekten de, CCL 19 stimülasyonu bu endekste bir düşüşe neden olur. Bununla birlikte, hücrelerin sadece yarısı polarize olduğundan, CCL 19 stimülasyonu üzerine gözlenen ortalama dairesellik indeksindeki değişiklik küçüktür.

Bu deneyde, T hücreleri, par altı polarite kompleksinin baskın negatif mutantlarını kodlayan plazmitlerle birlikte GFP ile kesildi. PKC zeta. Transfekte edilmemiş hücreler için histogram, ilgili GFP pozitif T hücreleri için spesifik geçitlemeye izin verdi ve tüm hücre popülasyonunun küçük bir kısmının transfekte edildiğini gösterdi.

Bu transfekte edilmiş hücrelerin morfolojik polarizasyon derecesi daha sonra sadece GFP pozitif hücrelerin dairesellik indeksi ve T hücreleri için ek bir yürüyüş ölçülerek ölçüldü. Alınan her koşul altında polarize hücrelerin yüzdesini tahmin etmek için düşük dairesellik değerleri sergilemek oluşturuldu. Birlikte, bu veriler, par altı PK CZ'nin sinyal yoluna fonksiyonunun bozulmasının, hem CCL 19 hem de c Xcl 12 kemokinleri tarafından indüklenen T hücresi polarizasyonunu inhibe ettiğini göstermektedir.

Önceki bulgularla uyumlu olarak. Bu prosedürü denerken, lenfositlerin güçlü ve güvenilir morfolojik polarizasyonunu sağlamak için insolution akraba stimülasyon adımı ve takip eden fiksasyon boyunca her zaman 37 santigrat derecede çalışmak çok önemlidir.