Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl hidrolizi, A Kolorimetrik Özellikle Granzim B proteolitik aktivitesini ölçer Deneyi
28 Kasım 2014
İnsan, fare veya sıçan Granzyme B'nin (GzmB) proteolitik aktivitesini spesifik olarak ölçen basit, kantitatif bir kolorimetrik testi tanımlıyoruz. Bu protokol, uygun bir tanıma dizisi ile diğer sentetik peptit substratlarının hidrolizi yoluyla diğer granül serin proteazların proteaz aktivitesini belirlemek için kolayca uyarlanabilir.
Aşağıdaki deneyin genel amacı, ine proteaz granzim B'nin proteolitik aktivitesini ölçmektir.Bu, önce ilgilenilen hücrelerin bir lizatının hazırlanması ve ardından numunelere hızlı bir şekilde substrat eklenmesiyle elde edilir. Granzim B aktivitesi daha sonra bir kolorimetrik reaksiyon ile ölçülür. Sonuç olarak, alla alla'nın granzim B tarafından s benzo olarak oldukça spesifik bölünmesi, bir spart asit kalıntıları için benzersiz substrat özgüllüğüne dayalı olarak değerlendirilebilir.
Bu tekniğin, PCR veya Western blot kullanılarak büyük bölge B ekspresyonunun saptanması gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, benzilin hidrolizinin büyük bölge B'ye özgü olması ve ayrıca proteazın aktif olduğunu göstermesidir. Hücreyi hazırlamak için, lizatlar önce birincil NK hücrelerini vahşi tip C 57 siyah altıdan dalakların tek hücreli süspansiyonlarından izole eder veya hücreler aktive edildikten sonra üreticinin talimatlarına göre ticari olarak temin edilebilen kitleri kullanarak negatif seçim yoluyla granzim B geni boş fareleri kontrol eder. Kültürü PBS'de iki ila üç saniye boyunca maksimum hızda üç kez yıkayın ve ardından 100 mikrolitre Nont P 40 lizis tamponunda en az 5 milyon NK hücresi içeren peleti 20 dakika boyunca buz üzerinde yeniden süspanse edin.
Daha sonra lizatı bir mikro santrifüjde 15.000 Gs'de 10 dakika döndürün ve sırtüstü ajanı yeni bir tüpe aktarın. Protein konsantrasyonunu belirledikten sonra, ticari olarak mevcut uygun protokole göre, büyük bir zime B aktivite testi gerçekleştirmek için sate'yi negatif 20 santigrat derecede mililitre konsantrasyon başına en az yaklaşık iki miligramda saklayın. Daha sonra, taze hazırlanmış yığın tamponunda numune başına en az 100 mikrogram protein lizatını 160 mikrolitrelik bir nihai hacme
seyreltin.Daha sonra çok kanallı bir pipet kullanarak, 96 oyuklu vinil U alt plakaya üç kopya halinde oyuk başına 50 mikrolitre numune yükleyin. Yalnızca üç tampon kontrol kuyusu eklemeye özen göstererek, her birine 100 mikrolitre seyreltilmiş DTNB ekleyin. Daha sonra, hızlı bir şekilde 50 mikrolitre taze seyreltilmiş alala, tek başına kuyucuk tamponu yığınlarının her birine benzoil substratı ekleyin, ardından herhangi bir negatif kontrol yapın ve beklenen pozitif numunelerle bitirin.
Her 15 saniyede 25 okuma alan bir kinetik tahlil protokolü kullanarak 405 nanometre optik yoğunlukta bir mikroplaka okuyucuda alala'nın benzil olarak hidrolizi ile aase aktivitesini ölçün. Son olarak, her bir kuyucuk için maksimum substrat bölünme oranını hesaplamak için plaka okuyucu yazılımını kullanın ve ardından ham verileri, granzim gen nakavt fareleri kullanarak uygun istatistiksel analiz yazılımına aktarın. Sentetik peptit substratının, benzil olarak alala'nın, granzim B tarafından spesifik olarak hidrolize edildiği keşfedildi.Sentetik substratın daha sağlam bölünmesi, vahşi tip birincil NK hücrelerinden hücre lizatlarında ölçülebilir, ancak granzim B nakavt hayvanlarından elde edilen NK hücrelerinde kontrol olarak ölçülemez.
Bu deneyde, tripsin benzeri substrat özgüllüğüne sahip olan ve her iki hücre tipinden lizatlarda bulunan granzim A'nın proteolitik aktivitesi, BLT benzilinin hidrolizi ile ölçüldüğü gibi eşitti, I-E-P-D-P-N-A, türler arasında granzim B aktivitesini test etmek için jenerik olarak kullanılmıştır. Bu temsili deneyde, tetra peptit dizilerinin analizi, insan granzim B'nin, hem insan hem de fare teklifindeki tanıma dizisiyle eşleşen IEPD dizisinden sonra verimli bir şekilde parçalanabildiğini ortaya koydu. Buna karşılık, insan NK lösemi hücre lizat miktarını 30 mikrogramdan 10 mikrograma düşürmek, I-E-P-D-P-N-A substratını hidrolize etmek için yeterli gram enzim B ile sonuçlanır.
Bu videoyu izledikten sonra, kırmızı insan ve fare enzimi B'nin in vitro analizi için uygun substratın ve deneysel kontrollerin nasıl seçileceğini iyi anlamış olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, insan, fare veya sıçan örneklerinde Granzyme B (GzmB) proteolitik aktivitesini ölçmek için kullanılan kantitatif bir kolorimetrik analiz sunmaktadır. Yöntem, farklı sentetik peptit substratlar kullanılarak diğer granül serin proteazlar için de uyarlanabilir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Proteaz Aktivitesi
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- Granzyme B, bağışıklık yanıtlarında rol oynayan bir serin proteazdır.
- Aktivitesinin ölçülmesi, hücre aracılı sitotoksisitedeki rolünün anlaşılması açısından kritik öneme sahiptir.
- PCR veya Western blot gibi mevcut yöntemler proteaz aktivitesini doğrudan ölçmez.
- Bu analiz, GzmB aktivitesinin spesifik ve doğrudan ölçümünü sağlar.
Çalışmanın Amacı
- GzmB aktivitesini nicelleştirmek için basit bir analiz geliştirmek.
- Diğer proteazlar için uyarlanabilecek bir yöntem sunmak.
- GzmB aktivitesine özgü bir yöntem sunarak mevcut teknikleri geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Primer NK hücrelerinden hücre lizatlarının hazırlanması.
- GzmB aktivitesini ölçmek için kolorimetrik bir reaksiyonun kullanılması.
- Vahşi tip ve granzyme B gen nakavt farelerin dalaklarından NK hücrelerinin izolasyonu.
- Proteaz aktivitesini değerlendirmek için substrat hidrolizi.
Ana Sonuçlar
- Deney, spesifik substrat cleavage işlemi aracılığıyla GzmB aktivitesini başarıyla ölçer.
- Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, GzmB için yüksek özgünlük sergiler.
- Sonuçlar, substrat hidrolizine dayanarak proteazın aktif olduğunu göstermektedir.
- Yöntem, diğer granül serin proteazlar için de uyarlanabilir niteliktedir.
Sonuçlar
- Geliştirilen analiz, GzmB aktivitesini ölçmek için güvenilir bir araçtır.
- Proteaz fonksiyonunu doğrudan değerlendirerek geleneksel yöntemlere göre avantajlar sunar.
- Bu yaklaşım, immün yanıtlar ve proteaz biyolojisi üzerine yapılan araştırmaları geliştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel İlgililik
Granzyme B proteolitik aktivitesinin doğru ölçümü, immünoterapi geliştirmede sitotoksik lenfosit fonksiyonunun doğrulanması için esastır. Bu kolorimetrik analiz, proteaz aktivitesinin doğrudan ve spesifik bir okumasını sağlayarak, preklinik modellerde hedef etkileşiminin ve pro-apoptotik potansiyelin mekanistik olarak riskten arındırılmasına olanak tanır. Türler arası uyumluluğu, kemirgen çalışmalarından insan uygulamalarına geçişte translasyonel sürekliliği destekler.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Sitotoksik lenfositlerde Granzyme B bağımlı apoptoz yolaklarının sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Aktif proteazı salt ekspresyondan ayırarak hedef doğrulamadaki yanlış pozitifleri azaltır.
- Öngörücü Değer: Granzyme B'nin immün aracılı tümör temizlenmesinde mekanistik bir sürücü olarak fonksiyonel onaylanmasını destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: İnsan, fare ve sıçan sistemlerinde yalnızca Granzyme B tarafından hidrolize edilen Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl substratını kullanır.
- Kantitatif Çıktı: Kinetik analiz için 405 nm'de DTNB-bağlı kolorimetrik reaksiyon aracılığıyla başlangıç hidroliz hızlarını ölçer.
- Özgüllük Kontrolü: Benzersiz aspartat tercihi sayesinde kaspaz ve diğer granzyme girişimlerini dışlar.
- Tekrarlanabilirlik: Uygun kontroller dahil edildiğinde, fraksiyona ayrılmamış lizatlar ve rekombinant proteazlar ile uyumludur.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlişkisi: Granzyme B'nin hedef hücre ölümünü yönettiği tümör immünosürveyans, viral enfeksiyon ve otoimmün patoloji modelleri için uygundur.
- Translasyonel Süreklilik: Türler arasında tutarlı aktivite ölçümü sağlayarak, fare verilerinden insan verilerine ekstrapolasyonu destekler.
- Riskten Arındırılmış Kararlar: Onaylanmış sitotoksik potansiyele sahip adayları önceliklendirmek için aktivite tabanlı biyobelirteç sağlar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu analiz, fonksiyonel proteaz aktivitesinin biyolojik etkinliği ve etki mekanizmasını belirlediği, hedef doğrulamadan öncü bileşik optimizasyonuna kadar uzanan keşif sürecine uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Granzyme B'nin, substrata özgü kesim yoluyla efektör lenfositlerde apoptozu tetiklediği hipotezini doğrular.
- Tarama: Koşulların veya genetik pertürbasyonların karşılaştırılması için standardize edilmiş, kantitatif aktivite okumaları sağlar.
- Analitik: Örnekler arası karşılaştırmaya ve proteolitik kapasitenin istatistiksel değerlendirmesine olanak tanıyan kinetik veriler (Vmax) üretir.
- Translasyonel Araştırma: İnsan, fare ve sıçan Granzyme B genelinde korunan aktiviteyi doğrulayarak preklinik validasyonu destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Substrat değişimi yoluyla diğer granül proteazlara platform düzeyinde uyarlanabilir, bu da uzun vadeli kullanım faydasını artırır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Proteolitik fonksiyonun doğrudan ölçümü, mRNA veya protein seviyeleri gibi sürrogat belirteçlere olan bağımlılığı azaltır.
- Operasyonel Değer: Minimum manuel işlem süresine sahip, plaka tabanlı basit format ve standart mikroplaka okuyucu uyumluluğu.
- Stratejik Değer: Yalnızca ekspresyona değil, fonksiyonel aktiviteye dayalı "devam/tamam" kararları verilmesini sağlayarak öngörü güvenini artırır.
- Portföy Etkisi: Geliştirme sürecinin erken aşamalarında mekanistik potensi onaylayarak, immünoterapilerin riske göre ayarlanmış şekilde ilerletilmesini kolaylaştırır.
Uygulama Hususları
- Proteaz aktivitesini korumak amacıyla, kontrollü koşullar altında primer bağışıklık hücresi izolasyonu ve lizisi konusunda uzmanlık gerektirir.
- Kinetik OD405 ölçümleri yapabilen bir mikroplaka okuyucuya ve uyumlu analiz yazılımına erişime bağlıdır.
- Kaynağında gösterildiği üzere, deney özgünlüğünü doğrulamak için Granzyme B nakavt kontrollerinin dahil edilmesini gerektirir.
- Diğer proteazlara uyarlama, eşdeğer özgünlüğü ve sinyal penceresini korumak için alternatif substratların doğrulanmasını gerektirir.
- Pratik sınırlama: Deney, toplam lizat aktivitesini ölçer ve hücre altı lokalizasyon çalışmaları için fraksiyonlama gerektirebilir.
