Embriyonik Fare beyninde İzleme Koşullu Genetik transsinaptik

Aşağıdaki deneyin amacı, embriyonik fare beynindeki nöral devrelerin gelişimini, çift yönlü hareket eden bir trans sinaptik izleyici, yalnızca geriye dönük bir şekilde hareket eden ikinci bir izleyici ve hedef hücreden hareket etmeyen üçüncü bir etiket kullanarak üç farklı hücre etiketleme sistemi kullanarak görselleştirmektir. Hedef nöron, yukarı akış nöronlarını ve aşağı akış nöronlarını tanımlamak mümkündür. Sonuçlar, bu deneysel protokolün, embriyonik dişi fare beynindeki nöral devrelerin oluşumunu tek bir hücre çözünürlüğünde analiz etmek için kullanılabileceğini göstermektedir.

Bu yöntem, belirli bir nöral devrenin ne zaman oluştuğu ve embriyonik gelişim sırasında nasıl organize edildikleri gibi gelişimsel sinirbilim alanındaki kilit soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu yöntem aynı zamanda yetişkin farelerde nöral devreleri izlemek için de kullanılabilir. Spesifik olarak, genetik olarak tanımlanmış nöronlar arasındaki sinaptik aktiviteyi analiz etmek için kullanılabilir ve farklı deneysel koşulların zaman içinde bir nöral devreyi nasıl modüle edebileceğini analiz etmek için kullanılabilir.

Yeni ötenazi yapılmış hamile bir fare ile başlayın. Karnının ventral tarafını% 70 etanol ile temizleyin ve ardından embriyoları ortaya çıkarmak için dikey bir kesi yapın. Embriyo zincirini çıkarın ve bunları tabaktaki buz gibi soğuk PBS tabağına aktarın.

Künt forseps kullanarak tek tek embriyoları çıkarın. İnce makas ve forseps kullanarak çözeltideki tek tek embriyoları ayırın ve embriyolar tamamen temizlendiğinde işlemde fazla dokuyu çıkarın. Her embriyodan küçük bir kuyruk biyopsisi alın ve cinsiyet tanımlama ve genotipleme için DNA toplamak üzere bir lizis tamponu tüpüne koyun.

Daha sonra embriyoyu taze yapılmış buz gibi, buz üzerinde% 4 PFA'ya aktarın. Her embriyoyu işledikten sonra, boyutlarına bağlı olarak en az 1.5 saat ajitasyon ile PFA'da inkübe etmelerine izin verin. Kuluçka tamamlandığında.

Sabit dokuları, yıkama başına en az beş dakika boyunca buz gibi PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra embriyoları dört santigrat derecede tutulan% 30'luk bir sükroz çözeltisine aktarın. Dokular çözeltiye tamamen battığında, kriyoseksiyon ile devam edin.

İlk olarak, kalıcı alkole dayanıklı işaretleyici kullanarak bir kriyo kalıbını etiketleyerek başlayın. Daha sonra, bulamacı kullanarak bir buz kovasında% 100 Etanol içinde kırılmış kuru buz bulamacı hazırlayın, bir cam isop pentan kabını yaklaşık 10 dakika soğutun. Beklerken, dokuları sakaroz solüsyonundan çıkarın ve fazla sakarozları standart bir laboratuvar mendili ile silin.

Daha sonra dokuyu önceden etiketlenmiş bir kriyo kalıba aktarın. Dokuyu kaplamak için yeterli OCT ile. OCT'de, özellikle doku çevresinde herhangi bir hava kabarcığı oluşturmayın.

Daha sonra, minimum hasara neden olmak için tüy ağırlığı entomoloji forseps kullanarak dokuyu yönlendirin. Kriyo kalıpları, gerekirse herhangi bir sıçramaya neden olmadan soğutulmuş izo pentan banyosunda dondurun. Donmuş kalıplar, kalıpları bölmek için eksi 80 santigrat derecede sarılabilir ve saklanabilir.

Beşli seriler halinde 14 mikron kalınlığında seri bölümler halinde kesin. Her beş dilim serisini bir süper don artı cam slaytta toplayın. Bu protokol için çözelti hazırlarken, taze olarak hazırlanması gereken TNT tamponuna ara 20'yi yavaşça eklediğinizden emin olun.

Ardından karıştırmak için çözeltiyi yavaşça yukarı ve aşağı yıkayın. TNB tamponunu hazırlarken, karıştırırken bloke edici reaktifi küçük artışlarla yavaşça ekleyin. Daha sonra bir su banyosu kullanarak çözeltiyi 55 santigrat dereceye ısıtın.

Çözelti sütlü hale gelecektir. Şimdi, dokular üzerinde çalışmaya başlamak için önce doku bölümlerini çevreleyen fazla OCT'yi çıkarmak için bir neşter kullanın. Ardından bir pap kalem kullanarak her bölümün sınırlarını işaretleyin.

Slaytların oda sıcaklığına gelmesine izin verin. Daha sonra oda sıcaklığında bir XPBS tamponu yıkayın, her yıkamada üç kez beş dakika uzunluğunda olmalıdır. Daha sonra, slaytları buz gibi soğukta yarım saat, metanol içinde% 0.3 hidrojen peroksit inkübe ederek endojen peroksidaz aktivitesini söndürün.

Bunu, yıkama başına beş dakika boyunca oda sıcaklığında PBS'de üç yıkama ile takip edin. Daha sonra dokulara nüfuz etmek için slaytları PBST'de 10 dakika inkübe edin. Bu sefer slaytları TNT ile üç kez yıkayın.

Şimdi nemlendirilmiş bir odada, dokuyu her slaytı kaplayacak kadar TNB'de bloke edin. Bloğun oda sıcaklığında yarım saat gitmesine izin verin. Slaytların kurumasına izin vermeyin.

Bloke edici tamponu boşalttıktan sonra, izleyiciyi bağlamak için slaytı TNB'deki birincil antikorla tamamen kapatın. RT'de iki saat veya gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Birincil antikoru çıkarmak için, slaytı TNT ile oda sıcaklığında yıkama başına beş dakika boyunca üç kez yıkayın.

Bu yıkamalar sırasında biraz hafif çalkalama kullanın. Daha sonra, ikincil antikor çözeltisindeki bölümleri bir saat boyunca inkübe edin. Daha sonra oda sıcaklığında, bağlanmamış ikincil antikoru çıkarmak için üç TNT yıkaması kullanın.

Daha sonra nemlendirilmiş bir odada, slaytları TNT'de yıkarken, dokuları TNB'de 30 dakika boyunca TNB'de bir ila 100 soyulmuş atta inkübe edin. İnkübasyondan sonra, taze bir TSA çözeltisi seyreltin. Şimdi taze yapılmış TSA seyreltmesini oda sıcaklığında tam olarak 10 dakika dokulara uygulayın.

TSA inkübasyonunun kesin zamanlaması kritiktir. Bu nedenle, elimizde bir seferde çok fazla slayt işlemeye çalışmayın. Bir adımda en fazla 10 slayt işlenebilir.

Ek slaytlar, başka bir yıkama turunun ardından işlenene kadar TNT yıkama tamponunda bekleyebilir. Dokuları bir ila 500 Alexa kat 5 46 soyulmuş olarak inkübe edin. TNB'de 30 dakika konjuge olarak bulundurun.

Oda sıcaklığında, soyulmuş habitant konjugatını üç tane daha TNT banyosu ile çıkarın. Daha sonra nükleer boyama için, PBS'de oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 5 BIS benza çözeltisi uygulayın, BIS benzo lekesini üç TNT yıkama ile çıkarın. Ardından slaytları floro Mount G ile monte edin ve analizlerine devam edin.

Açıklanan protokol kullanılarak, üreme eksenini düzenleyen nöral devrelerin olgunlaşması, R 26 BIZ ve R 26 GTT alellerini taşıyan farelerde analiz edildi. Transgenlerin ekspresyonu, bir öpücükten kırmızı renkte kisspeptin için çift immünofloresan ve Kisspeptin'e özgü bir creed sürücü hattı kullanılarak kavisli çekirdekteki embriyonik kisspeptin nöronlarında creed'e bağlı rekombinasyon ile aktive edildi. IC R 26 BIZ.

Fare, KISS IC R 26 GTT'de BL'nin aktivasyonunu gösteriyor Fare çift immünofloresansı, KISSPEPTIN'i yeşil renkte ve Cree sürücüsü tarafından etkinleştirilen GTT'yi kırmızı olarak gösteriyor. Bu ve diğer teşhisler, transgenlerin E 18.5 deneysel embriyolarında işlevsel olduğunu gösterdi. Kavisli çekirdekteki pepin nöronlarının zaten GNRH ile iletişim kurduğu bulundu.

Nöronların eksikliği Z, kisspeptin nöronlarını eksprese eden CRE ile sınırlıyken, BL trans sinaptik olarak yukarı ve aşağı akış nöronlarına aktarıldı. Bazıları, ama hepsi değil. GNRH nöronları bl içeriyordu.

Bu nedenle, embriyonik GNRH nöronlarının yalnızca bir alt kümesi, kavisli çekirdek kisspeptin nöronlarına sinaptik olarak bağlanır. GNRH nöronları retrograd izleyici içermiyordu. GTT, bu nöronların kisspeptin nöronlarının aşağı akışında olduğunu gösteriyor.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik bu prosedürü takip eden bir gün içinde uygulanabilir. Bağlı nöronların biyokimyasal yapısını tanımlamak için çift immünofloresan gibi diğer yöntemler kullanılabilir. Bu teknik, sinirbilim ve gelişim biyolojisi alanındaki araştırmacıların hem gelişim sırasında hem de yetişkin hayvanlarda tek bir hücre çözünürlüğü ile sinirsel bağlantıyı keşfetmelerinin önünü açmalıdır.

Bu videoyu izledikten sonra, farelerde nöral devrelerin oluşumunu ve olgunlaşmasını nasıl görselleştireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.