Nörolojik Hastalıklar Çalışmaları Yaratma ve Kullanma hiPSC Türetilmiş NPC A Guide

Bu prosedürün genel amacı, nörolojik hastalıklara katkıda bulunmak için hücresel ve moleküler mekanizmaları incelemek için bir platform olarak insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden veya yüksek PSC'lerden nöro progenitör hücreler veya NPC'ler üretmektir. Bu, ilk olarak çift smad inhibitörleri kullanılarak yüksek PSC'lerin nöral rozetlere ayırt edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, bu nöral rozetleri hasat etmek ve genişletilebilir N PC popülasyonlarına büyümelerine izin vermektir.

Bir spin enfeksiyonu ile sonraki lentiviral transdüksiyon. Verimliliği artırma adımı, gen ekspresyonunu manipüle etmek için kullanılır. Son adım, NPC'leri süspansiyon halinde büyütmektir, böylece kendiliğinden nöroküreler oluştururlar.

Sonuç olarak, bu platform çeşitli hücresel fenotipleri test etmek için kullanılabilir. Örneğin, genetik manipülasyonun nöro göç üzerindeki etkisini ölçmek. Bu yöntem, göç gibi hücresel mekanizmalar hakkında fikir verebilir.

Replikasyon, oksidatif stres, apoptoz ve nörit büyümesi gibi diğer biyolojik süreçleri incelemek için de uygulanabilir. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin veya yüksek PSC'lerin farklılaşması, 14. günde nöral rozetlerin enzimatik seçimi için aico bazal polariteye sahip yuvarlak nöro epitel hücre kümeleri olarak karakterize edilen görünür nöral rozetlerin oluşumuna yol açar. Yapışmış embriyo cisimlerinden veya ebs'den ortamı aspire edin ve altı Kuyulu plakanın oyuğu başına bir mililitre nöral roset seçim reaktifi ekleyin, bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Bir saat sonra. Enzimi her bir oyuktan nazikçe çıkarmak için bir P 1000 pipet adamı kullanın ve oyuk başına bir mililitre D-M-E-M-F 12 ekleyin. Rozetleri yıkamak için, bir mililitre D-M-E-M-F 12'yi toplayın ve hızlı bir şekilde kuyuya geri atın, böylece rozetleri plakadan çıkarın.

Rozetleri bir şahin tüpüne toplayın, bir mililitre daha D-M-E-M-F 12 pipetleyin ve kalan rozetleri çıkarmak için hızla aynı kuyuya atın. Denemeyin ve rozet agregalarını parçalamamaya çalışın. Nöral rozetleri aynı şahin tüpünde toplayın.

Daha fazla enzim eklenebilir ve tüm nöral rozetler toplandığında rozetler kolayca ayrılmazsa bu prosedür tekrarlanabilir. Falcon tüpünü 300 G'de üç dakika döndürün. Yıkamayı aspire edin ve yeniden canlandırın.

Rozetleri iki mililitre nöral progenitör hücre ortamında askıya alın. Hücreleri poli L ornitin laminat kaplı altı duvar plakasına aktarın ve bir hafta boyunca 37 santigrat derecede büyütün. Bu laboratuvarda, nöral progenitör hücreler veya NPC'ler matrijel plakalar üzerinde büyütülür, her iki günde bir beslenir ve çok yüksek bir yoğunlukta tutulur.

NPC'leri bölmek için, önce ortamı aspire edin ve ardından altı Kuyulu plakanın oyuğuna bir mililitre ılık accutane ekleyin, 37 santigrat derecede 10 ila 15 dakika inkübe edin. Ayrılan hücreleri, mümkün olduğunca az mekanik stresle D-M-E-M-F 12 içeren 15 mililitrelik bir tüpe nazikçe aktarın. Santrifüjlemeden sonra beş dakika boyunca 1000 G'de dönerek hücreleri pelet enzimi içindeyken hücreleri tritrat etmeyin, süpernatanı aspire edin ve NPC'leri yeniden askıya alın.

Altı oyuklu bir plakanın orijinal kuyusu başına yaklaşık bir mililitre NPC ortamında, yeniden süspansiyon ve hücre sayımını takiben altı oyuklu bir plakanın birleşen kuyusu başına beş ila 10 milyon hücre beklenir. NPC'leri korumak için NPC plakasını altı kuyulu bir plakanın kuyusu başına yaklaşık bir ila 2 milyon hücre şeklinde yeniden doldurun. Nöroküre oluşumunun verimliliği, deney ve hücre hatları arasında değişir, ancak genellikle en iyi, altı duvarlı yapışık olmayan bir plakanın kuyusu başına 200.000 ila bir milyon hücre oturtulursa, topaklanma meydana gelirse, oturan hücre sayısını azaltın İdeal olarak, bölünmeden sonraki bir ila iki gün içinde.

NP NPC'ler, transfekte edilmiş hücrelerin yüzdesini artırmak için lentiviral veya retroviral vektörlerle transdüksiyon yapılmalıdır. Spin enfeksiyonu kullanın. Ortamı her bir oyuktan aspire edin ve ilgili aşırı ekspresyon ile değiştirin veya seyreltilmiş istenen enfeksiyon bolluğuna titre edilmiş lentivirüsleri veya retrovirüsleri kontrol edin.

NPC ortamında, bir plaka santrifüjünde bir saat boyunca 1000 G'de ve oda sıcaklığında altı oyuklu bir plaka dönüşünün kuyusu başına 1,5 mililitre kullanın. Döndürme işleminden sonra, hücresel ölümü azaltmak için plakayı inkübatöre geri yerleştirin. Ortamı spin enfeksiyonundan sonraki sekiz saat içinde değiştirin.

Bu prosedüre, hücresel kalıntıları gidermek için NPC'den türetilmiş NEUROSPHERES'i NPC ortamında bir kez yıkayarak başlayın. Plakayı 45 derecelik bir açıyla eğin ve nörosferlerin yerleşmesine izin verin ve ardından nörosferleri aspire etmeden mümkün olduğunca fazla ortamı çıkarın. Yeni ortamla değiştirin.

Daha sonra, NPC'den türetilmiş NEUROSPHERES'i bir P 200 pipet kullanarak mikroskop altında manuel olarak seçin, matrigel kaplı 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna bir nöros küresi aktarın. Sonuçlardaki değişkenliği azaltmak için benzer boyutlarda nörosferlerin seçilmesi önemlidir. Her 96 oyuklu plakadaki nörosferlere soğuk NPC ortamında seyreltilmiş 0.5 miligram matri jel ekleyin.

Bir pipet ucu kullanarak, her bir nöros küresini kuyunun ortasında manuel olarak ortalayın Nöros küre göçünün 48 saat boyunca gerçekleşmesine izin verin. Hücreleri istenen immünohistokimyasal belirteçlerle sabitleyip boyadıktan sonra, bir Forex mikroskobu objektifi kullanarak nörosferleri bir bütün olarak fotoğraflayın. Radyal göçü ölçmek için image J yazılımını kullanın.

En uzak göç eden hücrelerin kenarını manuel olarak izlemek için serbest seçim aracını kullanın. Analiz sekmesi altında bulunan ölçümleri ayarla penceresinde bu alanın işaretli olduğundan emin olun. Ardından, elde edilen şeklin alanını hesaplamak için measure işlevini kullanın.

Dış yarıçapı aynı şekilde belirlemek için alan ölçümünün değerini ve bir dairenin alanı için denklemi kullanın, orijinal nöros küresinin kenarını izleyin. Alanı ölçün ve iç yarıçapı hesaplayın. Toplam radyal göçü, dış ve iç yarıçaplar arasındaki fark olarak hesaplayın.

Bu görüntüler, yüksek PSC'lerden embriyo cisimlerine, nöral rozetlere, NPC'lere ve NPC'lerin eksprese edildiği doğrulanmış nöronlara yüksek PSC nöral farklılaşmasının aşamalarını, NPC işaretleyici yuvalamasını ve çoğu hücrede nöral kök hücre transkripsiyon faktörü SOX ikisini gösterir. Beta üç tübülin boyaması da tüm NPC popülasyonlarında görülebilir. NPC'ler ayrıca nöral kök hücre transkripsiyon faktörü PAC six ve dört brainin progenitör markörünü de eksprese eder.

TBR iki, ancak LMX bir A ve FOX A gibi orta beyin belirteçleri değil, iki NPC, yeşil renkte gösterilen% 70 ila 80 beta üç tübülin pozitif nöronlara ve% 20 ila 30 glial fibriler asidik protein pozitif astrositlere farklılaşabilir, yüksek kaliteli yüksek PSC. NPC'ler çoğu hücrede neston ve SOX ikisini ifade ederken, düşük kaliteli NPC'ler SOX iki negatif yamalarına sahiptir ve yalnızca negatif hücrelerde yuvalanır. Yüksek kaliteli NPC'lerden ayrılan dört haftalık nöronlar, iki AB ve üç çalkantılı haritayı ifade eder.

Yüksek titreli lentiviral veya retroviral vektör ile başarılı transdüksiyonu takiben. Hücrelerin %80'inden fazlası floresan raportör tarafından etiketlenir. Vektör nöros küre üretimine dahil edilen, kültürde yaklaşık bir hafta boyunca sağlıklı kalabilen, nispeten homojen boyutta bir nöroküre popülasyonu verir.

Düzenli beslenme nörostrüktürü ile küre göçü, matrigelde migrasyondan 48 saat önce ve sonra bu parlak alan görüntülerinde gösterildiği gibi sağlıklı nörosferlerde sağlam bir şekilde gerçekleşir Gelişiminden sonra. Bu teknik, şizofreni alanındaki araştırmacıların, insan kaynaklı PL ponent kök hücre türevli NPC'lerde nöro göçü keşfetmelerinin yolunu açtı. Bir retrovirüs ile çalışmanın potansiyel olarak tehlikeli olabileceğini ve tüm doku kültürü çalışmalarının, virüsün potansiyel olarak mevcut olduğu BL iki artı koşullarında yapılması gerektiğini unutmayın.