Hematopoetik Hücre Otomatik Ölçümü - undekalsifiye Kemik histolojik Görüntüler stromal hücre etkileşimleri

Bu prosedürün genel amacı, kemik iliğindeki spesifik hücre alt kümeleri arasındaki ilişkileri ölçmektir. Bu, önce fare femur tümörlerinden histolojik kriyo kesitlerinin toplanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, immünofloresan analizi için kesitler boyanır ve konfokal görüntüler elde edilir.

Görüntüler daha sonra dijital olarak analiz edilir. Sonuç olarak, farklı hücre tiplerinin konumları, ilgilenilen spesifik immünolojik hücreler ile mikro çevreleri arasındaki temas oranlarını ve sıklığını hesaplamak için simüle edilebilir. Bu yöntem için ilk olarak kemik iliğindeki uzun ömürlü plazma hücreleri için mikroçevresel nişleri analiz ederken aklımıza geldi ve kemik iliği dokusu içindeki hücresel ilişkileri açık bir şekilde ölçmek için bir yönteme ihtiyacımız vardı.

RA Maya sizin için prosedürü gösterecek: Yetişkin bir fareden femur kemiklerini kriyo ile emmek. İlk olarak, sert doku bıçağı ile donatılmış standart bir mikrotomun numune ve bıçak sıcaklığını eksi 24 santigrat dereceye ayarlayın. 15 dakikalık bir alışma işleminden sonra.

Kriyo gömme ortamı ile metal numune tutucuya bir numune bloğu sabitleyin ve bloğun yönünü gerektiği gibi ayarlayın. Kemik tamamen açılana ve ilik görünene kadar numuneyi kesin. Ardından bir kesit kalınlığını yedi mikrona ayarlayın.

Ardından, sevgili bir deri kaplı tahta spatula kullanarak bir numune bloğunun üstüne yapışkan tarafı gelecek şekilde bir parça kawamoto yapışkan bandı sabitleyin ve numuneyi forseps kullanarak bölümlere ayırın. Bandı çevirin, böylece bölüm üst tarafa yerleştirildi. Ardından bandı bir cam mikroskop lamına aktarın.

Son kısım toplandığında bandı bantla cam kızağa sabitleyin. Numunelerin en az 30 dakika sürmesine izin verin ve slaytları eksi 80 santigrat derecede saklayın. İki kadın, örneklerin çözülmüş kriyo bölümlerini yaygın immünofloresan protokollerine göre boyadığını görüntülüyor.

Doku bütünlüğünü görselleştirmek için nükleer bir leke eklediğinizden emin olun. Bölümler boyandıktan sonra, her numuneye bir damla zemin montajı ekleyin, ardından lazer taramalı konfokal mikroskop üzerinde bir numaralı cam kapak kayması. 20x objektif lensi seçin ve 708 nokta 15 x 708 nokta 15 mikron alan görünümünü ayarlayın.

Ardından, sonuçları karşılaştırılabilir tutmak için örnekleri görüntü başına 2048 x 2048 piksel olacak şekilde birer birer görüntüleyin. Görüntülerin stromal yapıları görselleştirmek için bir kanala, çekirdekler için bir kanala ve gerektiğinde ilgilenilen hematopoetik hücreler için ek kanallara kaydedilmesi. Çizgi ortalamasını kullanarak görüntüleri kaydedin.

İdeal olarak, tüm femoral bölümü kaplamak için tek bitişik görüntüleri yakalar. Ardından görüntüleri bir mikroskopi görüntü dosyası biçiminde kaydedin. Ardından, görüntülenen her alan için kanal başına bir JPEG dosyasını dışa aktarın ve rastgele hücrenin simülasyonlarını yürütmeden önce görüntü segmentasyonunu, yerelleştirmenin nicelleştirilmesini ve komşuluk analizini gerçekleştirmek için bir görüntü analiz aracı kullanın.

Simüle edilecek her görüntü için analiz edilen kemik iliği görüntüleri üzerinde konumlandırma. Aşağıdaki dosyaları tek bir klasöre, hücre iletişim aracı tarafından sağlanan tek CSV dosyalarına yerleştirin. Tüm orijinal JPEG dosyalarını ve bunlara karşılık gelen tek CSV dosyalarını da şu anda başka bir klasöre aktarmak için tek bir femoral örnekten alınan görüntü dizisi üzerinde toplu simülasyonlar gerçekleştirmek için orijinal DPI kanalı JPEG dosyaları ve orijinal stromal kanal JPEG dosyaları.

Tüm dosyalar bir araya getirildiğinde, simülasyon aracını başlatın. Ardından görüntü verilerini otomatik yükle kutusunu işaretleyin. Bu seçenek işaretlendiğinde, analiz edilen görüntülere karşılık gelen CSV dosyaları otomatik olarak açılır.

Ardından, CSV dosyaları için ortak etiketi ve toplu mod simülasyonu için kullanılması gereken görüntü kümelerinin sayısını girin. Ardından, DPI kanalı için maskeyi oluşturmak üzere S stroma kanalından oluşturulan J peg dosyasını üç ile biten bir dosya adıyla yükleyin. Maske uygula kutusunu işaretleyin ve DPI görüntüsünü ikili maskeye dönüştürme eşiğini 10 olarak ayarlayın.

Sekiz bit ve genişletme kutularını işaretleyin ve genişleme derecesini beş piksel olarak ayarlayın. Ardından genişlik erozyonu kutusunu kontrol edin. Ardından, simüle edilmiş görüntülerin analizi için kullanılan çevre yarıçapı için istenen değeri girin ve hematopoietik hücreler için stromal yapıların otomatik olarak algılanması için OSU algoritmasını kullanmak üzere OSU kullan kutusunu işaretleyin.

Dairesel şekiller olarak simüle edilmiştir. Analiz edilen hücre tiplerinin hücre boyutu dağılımını, uygun nesne segmentasyon fonksiyonlarını içeren herhangi bir görüntü analiz yazılımı ile ölçün ve bu ölçümlerden tüm hematopoetik tipler için sigmayı belirleyin. Görüntü analiz aracı tarafından hala tam hücre olarak tanınan en küçük nesneyi tanımlayan piksel cinsinden çap olan hücre boyutu kesme değeri belirlenebilir.

Ardından, kırmızı, yeşil ve mavi hücreler için hücre boyutu dağılımının simülasyonu için hücre boyutu sınırını ve sigmayı piksel cinsinden girin. Daha sonra hücreler ve maske sekmesinde, maskenin girilmeyen bir alanı içinde en az bir pikselle çakışan bir hücre için programın yeni bir konum seçmesine izin vermek için sil kutusunu işaretleyin. Hücre dışlama sekmesi altında, hücre çakışmasını önleme kutusunu da işaretleyin.

Ardından, iki hücrenin merkezleri arasındaki izin verilen minimum mesafeyi piksel cinsinden girin. Örtüşme, bir hücrenin merkezinden diğerinin merkezine olan minimum mesafe ile tanımlanıyorsa, maksimum örtüşme alanını şu şekilde ayarlayın: %100Ardından simülasyon aracını 1000 tekrara ayarlayın. Ardından, partinin her bir görüntüsünün tüm tekrarları için simüle edilmiş nesnelerin koordinatlarını metin biçiminde enkaz dosyaları olarak kaydetmek için satışları otomatik kaydet kutusunu işaretleyin.

Kaydedilen dosyalar için de ortak bir etiket girin. Son olarak, simülasyonu çalıştır'a tıklayın ve kaydedilen her görüntüye karşılık gelen 1000 simüle edilmiş görüntü setinin ortalama temas ve çevre frekanslarını belirleyin. Bu bölme için, ortalama temas ve çevre, görüntü başına kaydedilen hücre sayısına göre sayılır ve frekansları, kaydedilen görüntünün otomatik kolokalizasyon analizinin sonuçlarıyla karşılaştırır.

Bu şekilde, eozinofillerin, plazma hücrelerinin ve B hücrelerinin floresan kimerik kemik iliği ile stromal hücre mikroçevresi ile bir lokalizasyon analizi sunulmaktadır. Hücre iletişim ve çevre araçları tarafından oluşturulan CSV dosyaları, kişi veya çevre sayılarının yanı sıra piksel cinsinden her hücre popülasyonu için hücre sayısını ve toplam alanı içerir. Rastgele hücre konumlandırmasının bir simülasyonunu gerçekleştirmeden önce, hücre boyutu dağılımını bir Gauss dağılımı olarak tanımlayan parametrelerin bu simülasyonda belirlenmesi gerekir, üç hücre popülasyonu için ölçülen sigmanın göreceli değerleri korunmuştur.

Piksel cinsinden tanımlanan Sigma değerleri, hücrelerin yerleştirilebileceği alanları tanımlamak için kaydedilen hücrelerin görsel görünümüyle eşleşecek şekilde ayarlanırken, DAPI kanalından bir maske oluşturuldu. Daha sonra ikili görüntüleri oluşturmak için en uygun yoğunluk eşiği olarak 10 değeri belirlendi. Plazma hücrelerinin, eozinofillerin veya B hücrelerinin stromal hücrelerle temaslarının ilgisi daha sonra beklendiği gibi test edildi.

Bu analizler, plazma hücreleri ve B hücreleri için simülasyona kıyasla kaydedilen görüntülerde önemli ölçüde daha yüksek temas oranları ortaya çıkardı. Buna karşılık, eozinofil stromal hücre teması için net bir fark gözlenmedi. Bu yöntem, immünoloji, hematoloji, patoloji veya kök hücre biyolojisi gibi kemik iliğinin karmaşık doku yapısının analizini gerektiren herhangi bir alandaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir.