Kolon Kök Hücre Mutasyonların Kantitasyonu

Bu prosedürün genel amacı, kolon kök hücrelerinde glikoz altı fosfat dehidrojenaz veya G altı PD genindeki fenotipik somatik mutasyonları ölçmektir. Hayvanların varsayılan genotoksik ajanlarla muamele edilmesinden sonra, bu, ilk olarak, bir G six PD mutasyonu taşıyan bir kök hücrenin dölünün bir kripti tam olarak doldurmasına izin vermek için uygun bir süre bekleyen ajan ile hayvanların muamele edilmesi, hayvanın kurban edilmesi, kolonun çıkarılması ve bir İsviçre rulosu haline getirilmesi ve dokunun sıvı nitrojen içinde dondurulmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, bir kriyostat kullanarak kolondan slaytlar üzerinde yedi mikron kalınlığında donmuş bölümler hazırlamaktır.

Doku 37 santigrat dereceye kadar ısıtılır ve daha sonra doku bölümlerinin etrafında doku boyama başına kuyucuklar oluşturulur. Son adım, doku kesitlerini G altı PD boyama karışımı ile inkübe etmek ve daha sonra kesitleri bir ışık mikroskobu altında analiz etmektir, G altı PD aktivitesine sahip hücreler maviye boyanırken, fenotipik mutasyonlara sahip olanlar beyazımsı görünür. Sonuç olarak, mutasyona uğramış kripslerin nicelleştirilmesi, mutasyon frekansını belirlemek için kullanılır.

Bu teknik, kök hücrelerdeki glikoz altı fosfat dehidrojenaz somatik mutasyonlarını ölçer ve bu, kolon karsinogenezinde kritik hücre popülasyonudur. Somatik kök hücre mutasyonlarını tanımlayarak, tedavi edilen hayvanlarda mutasyon sıklığını kolon kanseri olaylarıyla ilişkilendirmek mümkündür. Bu yöntem kolondaki kök hücre mutasyonları hakkında bilgi sağlayabilse de, diğer model organizmalara veya organ sistemlerine de uygulanabilir.

Bir kök hücre nişi tanımlanabilirse, genellikle bu yönteme yeni olan bireyler MBT çözeltisinin hazırlanması ile mücadele edeceklerdir. Çözündürücü. MBT çözümü, ayrıntılı talimatlara çok dikkat edilmesini gerektirir. Histolojik boyama çözeltisini hazırlamaya başlamak için, iki mililitre pH 7.4 fosfat tamponunda 35 mililitre optimum kesme sıcaklığına veya 50 mililitrelik bir tüpte OCT ortamına kadar ve pH kağıdı kullanarak birleştirmek için kuvvetlice çalkalayın.

Çözeltinin yaklaşık pH 7.4 olduğu doğrulandı. Daha sonra glikozda altı fosfat ve metin protokolünde belirtildiği gibi fosfat tamponunda çözülen bir DP ve magnezyum klorür çözeltisi ve yine, çözeltinin pH'ının yaklaşık 7.4 kaldığını doğruladı. M-M-P-M-S çözeltisini ekleyin ve kuvvetlice karıştırın.

Bu, ışığa maruz kalmayı en aza indirmek için çözeltiyi folyoya saran berrak, koyu kırmızı bir homojenat ile sonuçlanmalıdır. Çözelti bulanıklaşırsa, bir yağ banyosu ısınırken atılmalıdır. Ayrı olarak, 0.4 mililitre dimetilformamid, 0.4 mililitre susuz etanol ve MBT'yi iki mililitrelik bir O-ring kapaklı bir tüpte karıştırarak beş milimolar nitro mavi ila teraz oleum veya MBT çözeltisi hazırlayın, tüpü gevşek bir şekilde kapatın ve MBT eriyene kadar yağ banyosunda kuvvetli bir kaynama noktasına getirin.

Ardından, MBT çözeltisinin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin ve ardından OCT reaksiyon karışımına ekleyin. Çözelti zamanla rengi başlangıçtaki turuncu kırmızıdan koyu kırmızıya veya mora değiştirebilir. Hayvanları tedavi ettikten ve metin protokolünde belirtildiği gibi donmuş bölümleri hazırladıktan sonra, silikon gres ile birbirine bağlanmış iki çelik rondela kullanarak doku boyama için kuyular oluşturun, parfümü yıkayıcının tabanına yerleştirin ve çözeltinin yerleştirileceği merkezi kesin.

Savaş öncesi donmuş doku, 37 derecelik nemli bir odada 10 dakika boyunca kayar. Daha sonra, her bir doku bölümüne önceden hazırlanmış G six PD boyama karışımının yaklaşık yarım mililitresinde doku bölümlerini çevrelemek için kuyucukları slayt üzerine yerleştirin ve 45 ila 50 dakika inkübe edin. Slaytları sıcak odadan çıkarın ve paslanmaz çelik kuyuları slaytlardan dikkatlice çıkarın.

Slaytları uzun kenara yerleştirin ve reaksiyon karışımı karışımını boşaltın, ardından 30 ila 60 dakikalık bir yıkama ve 100 milimolar fosfat tamponu uygulayın. G six PD boyama solüsyonunun son izlerini gidermek için, artık fosfat tamponunu çıkarmak için slaytları ve deiyonize suyu beş ila 10 dakika durulayın. Son olarak, slayta damla damla floro jel ekleyerek dokuyu kapatın ve daha sonra analiz etmek üzere görüntüler elde etmek için 30 dakika kurulayın.

Slaytı bir ışık mikroskobuna yerleştirin ve dört DX büyütmeye ayarlayın. Ardından, incelenen toplam kript sayısını tahmin etmek için 5.0 megapiksel kamera ile lekeli doku bölümünün fotoğraflarını çekin. Her fare için, en küçük yüzey alanına sahip seviyeden bir bölüm seçin ve 10 x büyütme ile görüntüleyin.

Mutant crips sayısını sayın. Aşağıdaki kriterlere göre, tüm kript mavi renkten yoksundur. Kriptin dış yapısı sağlamdır.

Mutant, bitişik yedi mikronluk kesitlerde gözlemlenir ve iki gözlemci mutant olarak aynı kripti tanımlar. Bu bölümdeki kript sayısını görsel olarak sayın ve her iki nokta üst üste için taranan seviye sayısıyla çarpın. DNA'ya zarar veren ajan olan azoksimetan ile tedavi edilen farelerde gözlenen mutant Crips örnekleri, burada solda mutant bir kriptin dikey veya yukarıdan aşağıya bir görünümünü görüyorsunuz.

Sağda yatay veya yandan bir görünüm olsa da, bir kriptin mutant ilan edilmesi için, mahzen içindeki tüm hücrelerin kalması gerekir. Az miktarda beyaz içeren beyaz kriptler, kadeh hücrelerinden mukus üretimine bağlıdır. Mutasyon frekansı, gözlemlenen mutantların sayısının, mutant olmayan taranan toplam kript sayısına bölünmesiyle hesaplanır.

Bu prosedürü takiben, bir kattan daha az bir mutasyon frekansını temsil eden 10 ila eksi beşte bir mutasyon frekansını temsil eden kontrol farelerinden alınan kolonlarda kripsler gözlenirken, azoksimetan ile tedavi edilen fareler 4.44 kat 10 ila eksi dört arasında bir kök hücre mutasyon frekansı gösterdi. Glikoz x fosfat dehidrojenaz mutasyonlarının tipinin genetik analizi gibi diğer yöntemler, kimyasal ajanın bir mutasyonu nasıl yanlış kodladığı gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, potansiyel mutajenik ve kanserojen bileşiklerle tedavi edilen farelerde somatik kök hücre mutasyonlarının nasıl ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız.