NMR ile Gerçek zamanlı enzimatik Reaksiyon Hızı Ölçümleri için çözünme Dinamik Nükleer Polarizasyon Aletler

Bu deneyin genel amacı, dinamik nükleer polarizasyonla geliştirilmiş nükleer manyetik rezonans ile enzimatik süreçleri gerçek zamanlı olarak takip etmektir. Dinamik nükleer polarizasyon (DNP) ile geliştirilmiş sıvı haldeki manyetik rezonans, temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir: örneğin, bir molekül çiftinin hücre içinde veya in vivo olarak enzimatik dönüşüm oranlarının, bu molekül çiftini herhangi bir şekilde değiştirmek zorunda kalmadan nasıl belirleneceği. Çözünme DNP ekipmanımızın laboratuvarımıza kurulması ve Lozan'daki Arnaud Yorum Laboratuvarı'nda doktora yapan Dr. Riccardo Balzan'ın buraya gelmesi, araştırmamız için ileriye doğru atılmış büyük bir adımdır.

DNP, 500 megahertz NMR spektrometrelerimizde gerçekleştirebileceğimiz deneylerin hassasiyetini önemli ölçüde artırır. Bu DNP ekipmanı Fransa'da kurulan ilk ekipmandı ve bu ekipmanın işlevsel hale getirilmesinde NMR ekibimizin tüm üyelerinin yer aldığını belirtmek isterim ve özellikle araştırma mühendisimiz Gildas Bertho ve konferanslar maitre de konferansımız Fatiha Kateb'den bahsetmek isterim. Bu tekniğin ana avantajı, substratın ve endojen türevlerinin saniyeler içinde bir zaman çözünürlüğü ile doğrudan, gerçek zamanlı olarak ölçülmesine izin vermesidir.

Polarize edici çözelti için, karbon 13 gözlemleri için döteryumlu etanole iki ila bir hacimde döteryumlu su içinde 33 milimolar TEMPO radikali ile katkılı 1.12 molar, karbon 13 etiketli sodyum piruvat çözeltisinden iki mililitre hazırlayın. Kriyostat yazılım arayüzündeki soğuma düğmesine tıklayarak soğuma prosedürü boyunca dinamik nükleer polarizasyon veya DNP, kriyostat sıcaklığını düşürün. Doldurma prosedürü boyunca DNP kriyostatında sıvı helyum toplayın.

Kriyostat yazılım arayüzündeki doldurma düğmesine tıklayın. Ardından, optimize edilmiş polarizasyon solüsyonundan 300 mikrolitreyi DNP polarizör ile birlikte verilen numune kabına yerleştirin. Numune kabını, numune içerideyken yavaşça sıvı nitrojen banyosuna daldırarak dondurun.

Dondurma işleminden sonra numune kabında bulunabilecek sıvı nitrojeni, numune kabını sıvı nitrojen banyosundan çıkararak ve ters çevirerek ortadan kaldırın. Ardından, önce numune kabını numune tutucusuna yerleştirerek numuneyi kriyostata yerleştirin. Ardından, mikrodalga fırının dalga kılavuzunu numune tutucuya yerleştirmeden önce numune tutucuyu ana kriyostat ekine yerleştirin.

Bir Kelvin soğutma prosedürünü başlatarak kriyostat sıcaklığını düşürün. Kriyostat yazılım arayüzündeki bir Kelvin soğutma düğmesine tıklayın. Mikrodalga kaynağını açın ve kriyostat yazılım arayüzündeki mikrodalgalar açık düğmesine tıklayarak numuneyi ışınlayın.

Konektörü saat yönünün tersine 90 derece döndürerek ve çekerek NMR konsol algılama kanalının koaksiyel kablosunu spektrometre bobininden ayırın. Algılama kanalının koaksiyel kablosunu kriyostat NMR bobininin koaksiyel konektörüne takın. Ardından NMR konsol kablosunun erkek konektörünü, yönlendirme pimine dikkat ederek kriyostat NMR bobininin dişi konektörüne takın.

Sıkıca itin ve konektörü saat yönünde 90 derece döndürün. Kriyostat bölgesindeki katı haldeki NMR termal sinyalini, t beş dakikaya eşit bir aralıkta tekrarlanan kalibre edilmemiş, düşük çevirme açılı darbelerle basit bir darbe alma dizisi kullanarak ölçün. Ölçümü ayarladıktan sonra yazılımın komut satırına zg yazınız ve klavyede enter tuşuna basınız.

Polarizasyon prosedürünü başlattıktan sonra, termal sinyal ölçümü için kullanılan aynı prosedür ve koşullarla katı halde DNP ile geliştirilmiş NMR sinyalini ölçün. Konektörü saat yönünün tersine 90 derece döndürerek ve çekerek NMR konsolu algılama kanalı koaksiyel kablosunu kriyostat NMR bobininden ayırın. Ardından algılama kanalının koaksiyel kablosunu spektrometre bobininin koaksiyel konektörüne takın.

NMR konsol kablosunun erkek konektörünü, yönlendirme pimine dikkat ederek spektrometre bobininin dişi konektörüne takın. Sıkıca itin ve konektörü saat yönünde 90 derece döndürün. Mililitre sığır serum albümini başına 20 mikrogram ile reaksiyon tamponunda mililitrede bir birimde bir tavşan kası LDH çözeltisini taze olarak hazırlayın.

Daha sonra, spektrometre alan stabilizasyonuna veya kilitlemeye izin vermek için 478 mikrolitre reaksiyon tamponu, 2 mikrolitre LDH çözeltisi ve 20 mikrolitre döteryumlu su karıştırın. Daha sonra 500 mikrolitrelik çözelti hacmini 5 milimetrelik bir NMR tüpüne yerleştirin. Transfer tüpünü, hiperpolarize çözeltiyi transfer için kullanılan helyum gazından ayıran otomatik, özel yapım bir enjeksiyon cihazına bağlayın.

Cihaz, numune tüpüne otomatik olarak 500 mikrolitre hiperpolarize çözelti verir. Çözünmeden önce, 500 mikrolitre numune içeren beş milimetre NMR tüpünü 11.74 tesla NMR spektrometresinin izomerkezine yerleştirin. Çözünme ekleme kazanına 5 mililitre döteryumlu su yerleştirin.

Kriyostat yazılım arayüzündeki ısıtıcı hazırla düğmesine tıklanarak döteryumlu suyu dirençli tel vasıtasıyla yaklaşık 180 ila 200 santigrat derece sıcaklığa ulaşılana kadar basınçlandırın ve ısıtın. Kriyostat yazılım arayüzündeki SS İşlemleri düğmesine tıklayın. Ardından mikrodalga kılavuzunu çözünme ekinden çıkarın.

Çözündürme ekini numune tutucuya doğru kaydırın. Çözündürme eki, numune tutucunun altına ulaşmalı ve döteryumlu suyun kriyostata sızmasını önlemek için numune kabı ile sızdırmaz bir bağlantı yapmak için sıkıca itilmelidir. Önceden belirlenmiş zamanlanmış bir pnömatik valf işlemleri dizisi olan çözünme sırasını başlatmak için donanım tetiğine basın.

Çözünmeden hemen sonra, enjeksiyon cihazı 500 mikrolitre hiperpolarize çözeltiyi NMR spektrometresine yerleştirilen numune ile karıştırır. Çözünmeden sonra, spektrometredeki numuneden gelen NMR hiperpolarize sinyalini, substratın ve ürünün manyetizasyonunun ilerlemesini takip etmek için 10 derecelik bir dizi ile ölçün, 1.5 saniye aralıklı çevirme açılı darbe alma dizileri ile ölçün. Ölçümü ayarladıktan sonra yazılımın komut satırına zg yazınız ve enter tuşuna basınız.

Manyetizasyon tamamen gevşedikten sonra, NMR termal sinyalini, yaklaşık 3T1'e karşılık gelen, yaklaşık üç dakika aralıklı bir dizi 90 derecelik çevirme açılı darbe alma dizisi ile ölçün. Ölçümü ayarladıktan sonra yazılımın komut satırına zg yazıp enter tuşuna basın. Burada, tekrarlanan 10 derecelik çevirme açısı darbelerinden elde edilen spektrumların zaman seyri, tekniğin hassasiyetini ve zaman çözünürlüğünü gösterir.

Piruvat substratının ve laktat ürününün pik tanımlamasını takiben, metabolitlerin sinyal entegrasyonu yoluyla miktar tayini gerçekleştirilir. Enzimatik aktivite, doğrusal bir modele uydurularak ürün sinyal zaman seyrinden belirlenir. Ölçümü doğrulamak için, aynı miktar, ürün ve substrat sinyallerinin oranından ilk reaksiyon hızı ile değerlendirilir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, uygun şekilde yapılırsa yaklaşık iki saat içinde tam bir enzimatik aktivite ölçümü gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, NMR için oldukça polarize bir substratın nasıl üretileceğini, bir enzim içeren bir çözeltiye nasıl enjekte edileceğini ve DNP ile geliştirilmiş NMR kullanarak enzimatik aktiviteyi nasıl takip edeceğinizi anlamalısınız. Bu prosedürü denerken, enzimatik çözeltiyi taze enzim ve yardımcı substratlarla dikkatli bir şekilde hazırlamak ve numune tüpünde herhangi bir hava kabarcığını önlemek önemlidir.

Sıvı halde DNP ile geliştirilmiş manyetik rezonansın geliştirilmesiyle, araştırmacılar artık ürün oluşum hızını ölçerek çeşitli hücre türleri içinde substrat alımını ve enzimatik dönüşümünü keşfedebilirler. Kriyojenik ekipmanlarla ve yüksek manyetik alanlarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu ölçümler yapılırken kriyojenlere karşı kişisel koruma giymek ve manyetik nesnelerin yokluğunu doğrulamak gibi önlemler her zaman alınmalıdır.

Klasik NMR'den farklı olarak, çözünme DNP tabanlı NMR, substrata ve mevcut yaşam durumuna bağlı olarak en fazla dakikalık deneysel bir zaman penceresi ile sınırlıdır. Bu, bir D spektroskopisinin ötesine geçmenin önünde duruyor. Çözünme DNP NMR'nin klasik çok boyutlu NMR'nin çok yönlülük seviyesine getirilmesi için geliştirilmeye ihtiyacı var.