Modelleme Kemoterapi Dayanıklı Lösemi İn Vitro

Bu prosedürün genel amacı, dirençli akut lenfoblastik lösemiyi veya ALL'yi in vitro olarak daha iyi modellemektir. Bu yöntem, refrakter ALL tedavisinde kemik iliği mikro çevresinin ALL hücre kemoterapötik direncini nasıl etkilediği ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, refrakter ALL hücreleri üzerindeki ilaç savunuculuğunu incelemek için geleneksel hayvan modellerini kullanmaktan çok daha ucuz ve daha az zaman alıcı olmasıdır.

10 mililitre tümöre özgü kültür ortamında% 80 ila 90 birleşik kemik iliği stromal hücreleri veya osteoblastlarından oluşan 100 milimetrelik bir plaka üzerine beş ila 20 kez, 10 ila altıncı lösemik hücreleri tohumlayarak başlayın. Her dört günde bir, plakayı yana doğru eğin ve yapışan hücre tabakasını rahatsız etmemeye dikkat ederek ortamın bir mililitresi hariç hepsini aspire edin. Daha sonra, yapışan hücrelerin minimum düzeyde bozulmasını sağlamak için dokuz mililitre taze lösemik hücre kültürü ortamını yan taraftaki plakanın köşesine damla damla dikkatlice ekleyin.

12'den sonrath ko-kültür, yüzen lösemik hücreleri toplamak için kültür ortamını plaka üzerinde yaklaşık beş ila 10 kez yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyin. Ve hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Daha sonra, hücreleri, az önce gösterildiği gibi% 80 ila 90 birleşik kemik iliği stromal hücreleri veya osteoblastlardan oluşan yeni bir plakaya yeniden tohumlayın.

Dördüncü günde, lösemik hücrelerin üç alt popülasyonu oluşmuş olacak ve askıya alınmış lösemik hücreler ortamda serbestçe yüzecektir. Faz Parlak lösemik hücreler, yapışık hücre tek tabakasının yüzeyine yapışır ve Faz Dim lösemik hücreler tek tabakanın altına göç eder. G10 boncuk sütunlarını hazırlamak için, önce sütun başına 30 mililitre hücre kültürü ortamını bir su banyosunda 37 santigrat dereceye kadar yeniden ısıtın.

Ardından, cam yününü ince, gevşek teller halinde çekmek için cımbız kullanın. Ve gereken sütun başına 10 mililitrelik bir şırıngaya çok sayıda hafif paketlenmiş iplik katmanı ekleyin. Şırınga 2/3 oranında dolduğunda, uca kapalı konumda tek yönlü bir musluk takın ve şırıngayı, musluğun altına 50 mililitrelik bir konik toplama tüpünün yerleştirilebileceği kadar yüksek bir halka standına sıkıştırın.

Şimdi, şırınga kolonunun altına bir toplama tüpü yerleştirin. Ve cam yününün üzerine PBS'de asılı G10 parçacıkları damlaları eklemek için 10 mililitrelik bir pipet kullanın. İki mililitrelik bir pelet oluşana kadar G10 parçacıklarını eklemeye devam edin.

Ardından, önceden ısıtılmış ortamın iki mililitrelik alikotunu sütuna ekleyin. Ve vana vanasını yavaşça açın, böylece ortam kolondan damla damla dışarı akar. Kolondan 10 mililitre ortam tamamen boşaldığında, vanayı kapatın.

Akışı atın ve kolonun altına yeni bir toplama tüpü yerleştirin. Askıya alınmış tümör alt popülasyonunu hasat etmek için, ortamı lösemik hücre ko-kültür plakasından aspire edin ve plakayı bir kez nazikçe durulamak için aynı ortamı kullanın. Daha sonra, yüzen süspansiyon lösemik hücre alt popülasyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.

Phase Bright tümör alt popülasyonunu hasat etmek için, ko-kültür plakasına 10 mililitre taze ortam ekleyin. Ve yapışık hücre tek tabakasını yerinden çıkarmadan yapışık lösemik hücreleri çıkarmak için yaklaşık beş kez kuvvetlice durulayın. Ardından, Phase Bright alt popülasyonunu kendi 15 mililitrelik konik tüpüne aktarın.

Faz Dim tümör alt popülasyonunu hasat etmek için, kalan ortamı bir mililitrelik PBS durulama ile çıkarın. Ve hücreleri 37 santigrat derecede üç mililitre tripsin ile ayırın. Beş dakika sonra, yapışan hücreleri çıkarmak için plakanın kenarlarına hafifçe vurun, ardından enzimatik reaksiyonu durdurmak için bir mililitre FBS ekleyin.

Ardından, büyük hücre agregatlarını parçalamak için serumu üç ila beş kez durulayın. Ve saflaştırılmamış Faz Dim alt popülasyonunu yeni bir 15 mililitrelik konik tüpe aktarın. Tüm alt popülasyonlar toplandığında, hücreleri aşağı doğru döndürün.

Ve peletlerin her birini bir mililitre önceden ısıtılmış ortamda yeniden askıya alın. Musluk tamamen kapalıyken, her bir alt popülasyon için, 1.000 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, bir mililitrelik hücre hacminin tamamını, hazırlanan G10 sütunlarından birinin üstüne damla damla eklemek için hücrelerin G10 peletinin üstünde veya içinde kaldığından emin olun. Hücrelerin oda sıcaklığında 20 dakika boyunca G10 peleti üzerinde inkübe etmesine izin verin.

Ardından, sütuna bir ila üç mililitre taze önceden ısıtılmış ortam ekleyin. Ve vanayı, ortam sütunlardan yavaşça damla damla çıkacak şekilde açın. Sütunlara bir ila iki mililitrelik artışlarla önceden ısıtılmış ortam eklemeye devam edin.

Toplam 15 ila 20 mililitre lösemik hücre toplandığında, vanayı kapatın ve toplama tüpünü kapatın. Ardından, hücreleri döndürün ve peleti uygun aşağı akış analiz tamponunda yeniden süspanse edin. Yapışık hücre tabakasının triplizasyonunu takiben, ileri ve yan saçılma analizi ile iki farklı hücre popülasyonu gözlenir.

G10 ayrılmasından sonra, saf bir ALL hücre popülasyonu geri kazanılır. Özellikle ilgi çekici olan, kemik iliği stromal hücresinden veya osteoblast ko-kültürlerinden geri kazanılan tüm Faz Dim hücreleri, sitotoksik kemoterapiye maruz kalmalarını takiben çok az ölüm gösterir veya hiç ölüm göstermez. Bu prosedürleri denerken, lösemik hücrelerde meydana gelebilecek fenotipik değişiklikleri azaltmak için bu adımları mümkün olduğunca uygun bir şekilde gerçekleştirmeyi unutmamak önemlidir.

Bu teknik, lösemi araştırmaları alanındaki araştırmacıların kemoterapiye dirençli lösemiyi, kemik iliği mikro çevresine daha çok benzeyen bir in vitro modelde modellemeleri için bir yol sağlar.