Gelişim ve karakterizasyonu İn Vitro Mikrodamar Ağ ve Endotel kantitatif ölçümleri [Ca ²⁺] _I Ve Nitrik Oksit Üretimi

Bu prosedürün genel amacı, endotel hücrelerinin fizyolojik olarak ilgili kesme akışı altında büyümesine izin veren bir mikroakışkan cihaz geliştirmek ve kalsiyum ve nitrik oksit üretimlerinde agonistin neden olduğu değişiklikleri ölçmektir. Bu mesaj, in vitro mikrodamar modelini doğrulayarak ve in vivo ve in vitro çalışmalar arasındaki boşlukları doldurarak mikrodamar araştırmalarının geleceğini ilerletmeye yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajları, çeşitli vaskülatürleri taklit etmek için mikrokanalların çok yönlü tasarımıdır ve orijinal kültürlere koşullu statik olandan in vivo olarak daha yakın olan hücre kültürü ortamını iyileştirir.

Prosedürleri gösterenler, laboratuvarımdan ikisi olan Sulei ve Xiang olacak. Başlamadan önce, metin protokolünde açıklandığı gibi PDMS mikro kanal cihazlarını imal etmek için bir ana kalıp ve yumuşak litografi oluşturmak için standart fotolitografi kullanın. Mikrokanal cihazlarını hazırlamak için önce giriş ve çıkışı ince bir PDMS parçası ile kapatın ve cihazı ıslak mendil ile bir Petri kabının içine yerleştirin.

Ardından, çanağı Parafilm ile sarın ve cihazı en az üç saat boyunca UV ışığı altında sterilize edin. Bir sonraki adım fibronektini uygulamaktır. İlk olarak, girişe 30 ila 50 mikrolitre PBS damlatın.

Cihazı durulamak için çıkışta bir vakum oluşturun. Daha sonra, girişe mililitre fibronektin başına 100 mikrogramlık bir damla yerleştirin. Fibronektin çözeltisini yüklemek için çıkışta bir vakum oluşturun.

Ardından, girişi ve çıkışı kapatın. Çanağı tekrar Parafilm ile sarın ve cihazı gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, cihazı PBS ile üç kez manuel olarak durulayın.

Ardından, 30 ila 50 mikrolitre hücre kültürü ortamı ile doldurun ve cihazı en az 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatörde ısıtın. HUVEC'leri mililitre başına iki ila dört milyon hücrede yüzde sekiz Dekstran ile HUVEC kültür ortamına karıştırarak başlayın. Dekstran, viskoziteyi arttırmak ve böylece hücre tohumlamasını iyileştirmek için gereklidir.

Daha sonra, girişin üzerine 10 ila 20 mikrolitre hücre koyun ve bunları yerçekimi kullanarak veya çıkıştaki bir cam pastör pipetinden kılcal hareket kullanarak tanıtın. Ardından, cihazı 15 ila 20 dakika inkübe edin. Ardından, tohumlama durumunu mikroskop altında kontrol edin.

Gerekirse, istenen hücre yoğunluğunu elde etmek için daha fazla hücre yükleyin. Yeterli hücre yüklendikten sonra, Dekstran'ı çıkarmak için cihazı normal, ılık hücre kültürü ortamıyla nazikçe durulayın. Ardından, cihazı altı saat boyunca herhangi bir ortam perfüzyonu olmadan kültürleyin.

Ardından, uzun süreli perfüzyon için boru bağlantılarını ayarlayın. Cihazı bir Petri kabına bantlayın ve ardından giriş borusunu bir iğne ile bir şırıngaya bağlayın. Hortumu cihazın hem girişine hem de çıkışına yerleştirin.

Çıkış borusunu bir atık toplayıcıya bağlayın. Şimdi, bulaşığı ve atık kabını bir kuluçka makinesine yerleştirin. Şırıngayı uzun bir giriş tüpü ile inkübatör kapısından geçen harici bir perfüzyon pompasına bağlayın.

Ardından, perfüzyon hızını deneysel tasarıma göre ayarlayın. İyi kontrol edilen bir perfüzyonla, mikrodamar ağındaki kültür iki haftaya kadar korunabilir. Bu nedenle, farklı fizyolojik ve patolojik durumlar üzerinde hücresel ve hemodinamik ortamı taklit eden daha uzun süreli çalışmalara genişletilebilir.

VE-kaderin etiketlemesi gibi immüno-boyamaya başlamak için, önce hücreleri dört santigrat derecede 30 dakika boyunca yüzde iki paraformaldehit ile perfüze ederek sabitleyin. Antikorlarla bloke etmek, geçirgenleştirmek ve lekelemek için bir dizi perfüzyondan sonra, hücreler görüntülenene kadar cihazı dört santigrat derecede tutun. Hücrelerdeki kalsiyum konsantrasyonunu görüntülemek için, cihazı 37 santigrat derecede 15 dakika boyunca Ringer çözeltisinde mililitre albümin başına 10 miligram ile perfüze edin.

Daha sonra, cihazı 37 santigrat derecede 40 dakika boyunca beş mikromolar Fluo-4 ile perfüze edin. Ardından, lümene bağlı Fluo-4'yi albümin Ringers ile 37 santigrat derecede 15 dakika boyunca yıkayın. Ardından, Fluo-4 ile hücreler arası kalsiyum seviyesi görüntüleme için konfokal sistemi başlatın. Fluo-4 yüklü mikro damarların görüntülerini elde edin.

Temel görüntüleri 10 dakika boyunca toplayın. Ardından, cihazı 10 mikromolar ATP ile sürekli olarak perfüze edin ve floresan yoğunluğundaki değişiklikleri 20 dakika boyunca kaydedin. Hücrelerdeki nitrik oksit üretimini görüntülemek için, cihazı 37 santigrat derecede 15 dakika boyunca albümin Ringers ile perfüze edin.

Daha sonra, hücreleri 5 mikromolar DAF-2 DA ile 37 santigrat derecede yaklaşık 35 ila 40 dakika perfüze edin. Ardından, ATP'nin neden olduğu nitrik oksit üretimini ölçmek için floresan görüntüleme sistemini kurun. Taban çizgisini 5 dakika boyunca kaydedin, ardından cihazı 10 mikromolar ATP ile perfüze edin ve görüntüleri bir dakikalık aralıklarla 30 dakika boyunca toplayın.

Hücre nitrik oksit ölçümü için, yoğunluk profili için ayırma adaptörünün bir nitrik oksit konsantrasyonunu değil, zamanla kümülatif bir nitrik oksit üretimini temsil ettiğini anlamak önemlidir. Toplanan görüntülerden tek tek hücre düzeyinde ilgi bölgesini manuel olarak seçin. Her ROI, floresense taslağı ile gösterilebilen bir bireyin hücresinin alanını kapsar.

Endotelyal kalsiyum ve nitrik oksitte ATP'nin neden olduğu değişiklikleri ölçün. Fluo-4'ün floresense yoğunluğundaki değişiklikleri hesaplayarak, doku arka planı daha azdır. Zaman içinde DAF-2'nin floresense yoğunluğunun ilk diferansiyel dönüşümünü gerçekleştirerek azot oksit üretim hızını ölçün.

Cihazdaki mikro kanal deseni, üç seviyeli bir dallanma ağına sahiptir. Dakikada 0,35 mikrolitre akış hızı altında kesme gerilimi dağılımlarını tahmin etmek için bir 3D sayısal simülasyon gerçekleştirildi. Endotel hücreleri tarif edildiği gibi ağa tohumlanıyordu.

Daha sonra F-aktin ve çekirdekler etiketlendi. Benzer şekilde, VE-cadherin de lekelendi. Sonuçlar, sağlam bir venüldeki VE-kaderin ekspresyonuna benzerdi.

Daha sonra, hücre içi kalsiyum ve nitrik oksit üretiminde ATP'ye bağlı artışlar incelendi. Kalsiyum seviyeleri, protokol bölümünde anlatıldığı gibi Fluo-4 kullanılarak incelendi. Nitrik oksit üretimi, protokol bölümünde açıklandığı gibi DAF-2 DA kullanılarak izlendi.

Sonuçlar, ayrı ayrı perfüze edilmiş bozulmamış venüllerle türetilenlerle karşılaştırılabilirdi. Gelişmiş, biyolojik koşullarda ve dinamik akışkan ortamlarda kolay ve sıkı bir şekilde kontrol edildi, bu da geleneksel mikro beceri teknikleriyle mümkün olmayacaktı. Bu videoyu izledikten sonra, cihazın nasıl üretileceğini ve kalsiyum ve nitrik oksit ölçümlerinin nasıl yapıldığını iyi anlamalısınız.

Bu teknik, araştırmacıların sadece altta yatan agonist kaynaklı araştırmaları için değil, aynı zamanda biyomedikal araştırmalar için daha geniş uygulamalar açmaları için de yol açtı.