Tümör mikroçevresinde Gerçek zamanlı Multisellüler Dynamics Genişletilmiş Time-lapse intravital Görüntüleme
12 Haziran 2016
Bu protokol, tek bir hücre çözünürlükte in vivo olarak, gerçek zamanlı olarak çok-etkileşimlerin uzatılmış zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirmek için multiphoton mikroskobu kullanımını tarif eder.
Bu prosedürün genel amacı, yüksek çözünürlüklü, intravital çok fotonlu mikroskopi aracılığıyla tümör mikroçevresindeki dinamik olayları görselleştirmektir. Bu yöntem, vasküler geçirgenlik ve çok hücreli etkileşimlerde hangi dinamik olayların rol oynadığı gibi tümör mikroçevresine dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tümör mikroçevresindeki olayların kinetiğinin gözlemlenebilmesi ve ölçülebilmesidir.
Prosedüre başlamadan önce, iki foton lazerleri ve dedektörler dahil tüm mikroskop ve lazer bileşenlerini açın. Ardından, sahneyi ön ısıtmak için ısıtma kutusunu 30 °C'ye ayarlayın. Mikroskop sahnesini ve sahne ekini %70 etanol ile silin.
Sahne kuruyken, lam örtü camı ile optik teması sürdürmek için 25 x 1.05 NA mikroskop objektifine büyük bir su damlası yerleştirin ve görüntüleme portu girişinin üzerine 1.5 kalınlığında bir örtü camı koyun. Ardından, 30 santimetrelik bir parça polietilen tüp kesin. Kauçuk pedi örtü camının üzerine yerleştirin.
Pens kullanarak, 31 gauge bir iğneyi plastik başlığından kırın ve iğne göbeğinin küt ucunu tübe yerleştirin. PE tübün diğer ucuna 31 gauge bir iğne yerleştirin ve sabitleyin. Ardından, bir cc'lik bir şırıngayı steril PBS ile doldurun ve şırıngayı 31 gauge iğneye takın.
Hortumdaki ve iğnedeki tüm havayı dışarı atmak için PBS kullanın. Ardından, bir adet 1 cc'lik şırıngayı 200 µL uygun vasküler etiketle ve bir diğerini uygun enjekte edilebilir proteinle doldurun. Cerrahi işleme başlamadan önce, ayak parmağı sıkıştırma yöntemine yanıt alınmadığından emin olarak anestezinin uygunluğunu doğrulayın ve anestezi altındaki fareye göz pomadları uygulayın.
Ardından, kuyruk dolaşımını artırmak için hayvanı bir ısı lambası altında cerrahi platforma yerleştirin. İki dakika sonra kuyruğu %70 etanol ile sterilize edin ve 31 gauge kateterin ucunu lateral kuyruk venine iki ila üç milimetre derinlikte yerleştirin. Daha sonra, iğneyi kuyruk boyunca vene paralel tutmak için kateterin üzerine bir santimetre uzunluğunda laboratuvar bandı yapıştırın.
Kateter sabitlendikten sonra, ventral yüzeyi ve tümör yüzeyini %70 ethanol ile silin. Ardından, karın üzerindeki deriyi kaldırın ve peritona zarar vermemeye dikkat ederek, karnın ventral orta hattı boyunca yaklaşık bir santimetrelik subkutan bir insizyon yapmak için steril makas kullanın. Tümörü açığa çıkarmak için meme bezini ve tümörü peritona bağlayan bağ dokusunu nazikçe kesin.
Ardından, makas ve pens kullanarak tümörün açığa çıkan yüzeyindeki fasya ve yağ dokusunu nazikçe temizleyin. Tümör açığa çıktıktan sonra, fareyi önceden ısıtılmış görüntüleme tablasına aktarın. Lamine camı sabitlemek için laboratuvar bantları kullanın ve ardından tümörü, mikroskop objektifinin üzerindeki lamine camı örten kauçuk bir pedin deliğine yerleştirin.
Hayvan uygun pozisyona getirildiğinde, dokuyu nemli tutmak ve lamel ile optik teması sürdürmek için kauçuk ped haznesini PBS ile doldurun. Hayvanın yaşamsal bulgularını izlemek için boyun çevresine bir nabız oksimetresi probu kolye sensörü yerleştirin ve ısıtma kutusunu hayvanın üzerine koyun. Ardından, tümör yüzeyindeki floresan tümör hücrelerine ve kan akışının olduğu bölgeye odaklanmak için mikroskop IP'lerini kullanın.
İlgilenilen bölge seçildikten sonra, mikroskobu çok fotonlu görüntüleme moduna getirin ve objektifi istenen başlangıç konumuna taşımak için odak ayarlayıcıyı kullanın. Ardından, z serisinin üst sınırını belirlemek için Z konum üst düğmesine tıklayın ve tümör yüzeyindeki kolajen fiber ağını ikinci harmonik üretimi kanalında görselleştirin. Daha sonra objektifi istenen görüntüleme derinliğine getirin ve z serisinin alt sınırını belirlemek için z konum alt düğmesine tıklayın.
Ardından, adım boyutu alanlarına istenen değeri girin. Daha sonra, Time Lapse Paneline geçin ve uygun lapse süresini girin. Görüntüleme parametreleri belirlendikten sonra, katetere bağlı şırıngayı vasküler işaretleme boyası içeren bir şırınga ile değiştirin ve çözeltinin vena içine girdiğinden emin olarak, boya çözeltisinden maksimum 200 µL'yi yavaşça uygulayın.
Enjeksiyondan sonra, PBS şırıngasını katetere geri takın ve z adımlı zaman atlamalı görüntülemeye başlayın. Tüm görüntüler elde edildiğinde, hatta hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek, PBS şırıngasını enjekte edilebilir protein içeren şırınga ile değiştirin. Ardından, protein süspansiyonunu fareye yavaşça enjekte edin ve şırıngayı PBS içeren bir şırınga ile değiştirin.
Makrofajlar, fagositoz yapan makrofajlarda biriken floresan işaretli 70 kilodalton ve dekstran ile takip edilebilir. Tümör hücrelerinin ve makrofajların çiftle işaretlenmesi, bu iki hücre tipinin doğrudan etkileşiminin gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesine olanak tanır. Tümör vasküler geçirgenliğindeki değişiklikleri görselleştirmek için vasküler alanı işaretlemek amacıyla kuantum noktaları da kullanılabilir.
Interarteriyel boşluklardan kolayca difüze olamayacak kadar büyük oldukları için, sürekli yüksek çözünürlüklü görüntüleme, vasküler geçirgenlik olaylarının yakalanmasını ve dekstran ekstravazasyon ve klirens kinetiğinin nicelendirilmesini kolaylaştırır. Bu örnek görüş alanında, ekstravasküler TMR sinyalinin kanıtladığı üzere, vasküler di-ekstravazasyonun zirvesi 29 ile 34. dakikalar arasında gözlemlenmektedir.
Vasküler geçirgenliği indüklemek için ek vasküler boyalar veya proteinlerin enjekte edilmesi, vasküler geçirgenliği düzenleyen sinyalizasyon olayları hakkında bilgi sağlayabilir. Nitekim, enjeksiyondan sonraki ilk birkaç saniye içinde, 10 kilodaltonluk FITC dekstranın damar dışına sızdığı gözlemlenebilirken, 155 kilodaltonluk TMR dekstran vasküler alanla sınırlı kalır. Bu teknik bir kez kavranıldığında, uygun şekilde uygulandığı takdirde bir saat içinde tamamlanabilir.
Bu prosedürü uygularken, tümör yüzeyine zarar vermeden bağ dokusunu nazikçe temizlemeyi ve tümör yüzeyini nemli tutmayı unutmamak önemlidir. Hücresel dinamiklere yönelik bu prosedürün ardından, tümör hücresi göçünün yönü ve intravazasyon hakkındaki ek soruları yanıtlamak için söz konusu tümör hücresi göçü görselleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, intervital çok fotonlu mikroskopi ile bir tümör mikroçevresindeki dinamik hücresel olayların nasıl görselleştirileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmanız gerekir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, tümör mikroçevresindeki dinamik olayları gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için çok fotonlu mikroskobinin kullanımını açıklamaktadır. Bu teknik, tek hücre çözünürlüğünde genişletilmiş zaman atlamalı görüntülemeye olanak tanıyarak damar geçirgenliği ve çok hücreli etkileşimler hakkında bilgiler sunar.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyoloji
- Mikroskopi
Arka Plan
- Çok fotonlu mikroskopi, yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar.
- Özellikle canlı dokuların incelenmesinde kullanışlıdır.
- Tümör mikroçevresi karmaşık ve dinamiktir.
- Hücresel etkileşimlerin anlaşılması, kanser araştırmaları için kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- Tümör mikroçevresindeki dinamik olayları görselleştirmek.
- Vasküler geçirgenliğin kinetiğini ölçmek.
- Çok hücreli etkileşimleri in vivo gözlemlemek.
Kullanılan Yöntemler
- İntravital çok fotonlu mikroskopi.
- Genişletilmiş zamanrağmenli görüntüleme.
- Tek hücre çözünürlüklü teknikler.
- Mikroskobun ve numune tablasının hazırlanması.
Ana Sonuçlar
- Tümör mikroçevresindeki dinamik olaylar başarıyla görselleştirildi.
- Vasküler geçirgenlik değişiklikleri gerçek zamanlı olarak gözlemlendi.
- Çok hücreli etkileşimler yüksek çözünürlükte belgelendi.
- Yöntem, olay kinetiğini ölçme yeteneğini kanıtladı.
Sonuçlar
- Çok fotonlu mikroskopi, kanser araştırmaları için güçlü bir araçtır.
- Gerçek zamanlı görüntüleme, tümör biyolojisine dair değerli bilgiler sağlar.
- Bu teknik, kanser dinamikleri konusundaki anlayışımızı geliştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Uygunluğu
Tümör mikroçevresindeki çok hücreli dinamiklerin gerçek zamanlı görselleştirilmesi, metastaz ve anjiyogenezi anlamak için kritik olan vasküler geçirgenlik ve tümör hücresi motilitesi gibi geçici olayların doğrudan gözlemlenmesine olanak tanır. Bu yaklaşım, uç nokta analizlerinin yakalayamadığı kinetik veriler sağlayarak onkoloji hedef doğrulamasında mekanistik risk azaltımını destekler. Stromal-tümör etkileşimlerinin zamansal çözünürlüğünü yakalayarak, bu yöntem preklinik modellerdeki öngörü güvenini artırır ve terapötik adayların önceliklendirilmesine yardımcı olur.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Tümör ilerlemesini tetikleyen stromal-tümör etkileşimlerini gerçek zamanlı olarak görselleştirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Canlı dokudaki çok hücreli olayların doğrudan gözlemi yoluyla fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler.
- Öngörücü Değer: Yolak risk azaltma ve portföy önceliklendirmesine bilgi sağlamak için vasküler geçirgenliğin ve hücre hareketliliğinin kinetiğini ölçer.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Tümör mikroortamında temel dinamikleri belirleyerek, sonraki tarama aşamaları için doğrulanmış biyolojik sistemler hazırlar.
- Operasyonel Değer: Dekstran ekstravazasyonunun ve temizlenmesinin zaman içindeki ölçülebilir çıktıları aracılığıyla analiz standardizasyonunu sağlar.
- Ölçeklenebilirlik Değeri: Boylamsal çalışmalar için standartlaştırılmış cerrahi hazırlık ve görüntüleme parametreleri ile platformun yeniden kullanımını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Değer: Canlı fare modellerinde insan benzeri çok hücreli etkileşimleri yakalayarak hastalıkla olan ilgiyi korur.
- Preklinik Süreklilik: Vasküler geçirgenliğin kinetik biyobelirteçlerini sağlayarak keşif ve preklinik doğrulama arasında köprü kurar.
- Riskten Arındırılmış Kararlar: Tümör mikroçevresi modülasyonunun gerçek zamanlı fonksiyonel okumalarına dayalı olarak devam/dur kararlarının verilmesini sağlar.
İş Akışı ve Süreç Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef doğrulamadan preklinik değerlendirmeye kadar uzanan keşif sürekliliğine entegre olarak, etki mekanizması çalışmalarında fonksiyonel çıktılar şeklinde vasküler geçirgenliğin ve hücresel hareketliliğin kinetik analizine olanak tanır.
- Keşif Biyolojisi: Tümör hücresi migrasyonunun ve intravazasyon olaylarının yönelimini gerçek zamanlı olarak görselleştirerek hipotez testlerini destekler.
- Tarama: 29–34 dakika arasındaki dekstran ekstravazasyon pikleri gibi kantitatif, zamana bağlı çıktılar sağlayarak bileşik etkilerinin karşılaştırılmasına olanak tanır.
- Analitik: Vasküler permeabilite ve hücresel temizlenmeye yönelik kinetik eğriler oluşturarak doz-yanıt ve hedef etkileşim analizlerini kolaylaştırır.
- Translasyonel Araştırma: Farmakolojik modülasyon sonrası vasküler dinamiklerdeki ölçülebilir değişiklikler aracılığıyla preklinik validasyon ile bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Standartlaştırılmış etiketleme ve cerrahi protokollerle, onkoloji projeleri boyunca tekrarlanan kullanımlar için yeniden kullanılabilir bir intravital görüntüleme platformu oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Tümör-stroma sinyal yolaklarındaki mekanistik belirsizliği azaltarak öngörülebilir güven sağlar.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış vasküler etiketleme, cerrahi hazırlık ve zaman atlamalı görüntüleme parametreleri aracılığıyla tekrarlanabilirliği sağlar.
- Stratejik Değer: Etkisiz modülatörlerin erken tespitine olanak tanıyarak geç aşama başarısızlık riskini azaltır ve sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Gerçek zamanlı vasküler geçirgenlik değişiklikleri üzerinden hedef etkileşimini nicelleştirerek riske göre ayarlanmış ilerlemeyi destekler.
Uygulama Hususları
- Çok fotonlu mikroskopi, intravital cerrahi ve floresan işaretleme stratejileri konusunda uzmanlık gerektirir.
- Çok foton kapasiteli mikroskoplara, ayarlanabilir lazerlere ve ikinci harmonik ile floresan kanalları için hassas detektörlere bağımlıdır.
- İşaretleme protokollerinin (örneğin, vaskülarizasyon için kuantum noktaları, makrofajlar için dekstran) ve görüntüleme parametrelerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Tümör modelleri arasında adaptasyon değerlendirmelerini içerir; cerrahi erişimin ve optik pencere uygunluğunun doğrulanmasını gerektirir.
- Uzun süreli görüntüleme sırasındaki fototoksisite riskleri ile sınırlıdır; güç optimizasyonu ve hayvan yaşamsal bulgularının izlenmesini gerektirir.
