Yüksek verim Tek hücreli İzolasyonu ve Kültür mikroakışkan Platformu

Bu protokolün genel amacı, yüksek verimli tek hücreli izolasyon ve kültüre izin veren bir mikroakışkan çipin üretimini ve çalışmasını göstermektir. Bu yöntem, tek hücreli izolasyon ve kültürden yararlanabilecek herhangi bir alan için yararlı bir araç sağlar. Bu tekniğin ana avantajı, tek hücreleri büyük mikro kuyu dizilerine yüklemede oldukça verimli olmasıdır.

Ek olarak, cihazı çalıştırmak için yalnızca yumuşak akış ve yerçekimi kuvveti kullanılır, bu da hücre hasarını en aza indirir. Bu tekniğin anlamı, hücresel heterojenitenin hücrenin tepkisini etkilediği kanser gibi insan hastalıklarının son teşhisine yöneliktir, bu nedenle mikrokuyu hücre hattını kurarken bu yöntemi geliştirme fikrini ortaya attık, çünkü limit seyreltme yöntemi çok zaman alıcı ve verimsizdi. Şimdi bu yöntem, bireysel hücre analizi hakkında bilgi sağlayabilir.

Bireysel hücre seyri ve davranışının kurulması ve gözlem zamanının belirlenmesi gibi diğer uygulamalara da uygulanabilir. Başlamak için, ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi standart fotolitografi kullanarak hem tek hücreli izolasyon katmanı hem de mikrokuyu kültür katmanı için silanize ana kalıplar üretin. Her ana kalıp için, 16 gram PDMS bazını tek kullanımlık bir kapta 1.6 gram kürleme maddesi ile birleştirin ve karışımları birleşene kadar karıştırın.

Ardından, ana kalıpları 150 milimetrelik petri kaplarına yerleştirin ve PDMS'yi kalıpların üzerine dökün. Petri kaplarını bir kurutucuya yerleştirin ve PDMS'deki hava kabarcıklarını gidermek için bir saat boyunca vakum uygulayın. Bir saat sonra, bulaşıkları kurutucudan çıkarın ve PDMS'yi iyileştirmek için üç ila altı saat boyunca 65 santigrat derecede geleneksel bir fırına koyun.

Ardından bulaşıkları fırından çıkarın ve oda sıcaklığına soğumaya bırakın. Soğuduktan sonra, kürlenmiş PDMS yakalama kuyusu dizisini ve mikro kuyu kültür dizisini ana kalıplardan soyun ve cihazları bir tıraş bıçağı kullanarak kesin. Ardından, yakalama kuyusu dizisi katmanındaki mikro kanalın her iki ucunda bir delik oluşturmak için 0,75 milimetrelik bir zımba kullanın.

Cihazın iç yüzeyi haline gelecek olanı temizlemek için bant kullanın ve ardından kısa bir oksijen plazma tedavisi için iç yüzeyler yukarı bakacak şekilde tek tek katmanları bir plazma temizleyiciye yerleştirin. Bitirdiğinizde, PDMS katmanlarını plazma temizleyiciden çıkarın ve cihazın üst ve alt katmanlarını hizalamak ve bağlamak için bir stereo mikroskop kullanın. PDMS katmanları arasında kalıcı bir bağ oluşturmak için hizalanmış cihazı 24 saat boyunca 65 santigrat derecede bir fırına yerleştirin.

Ardından, bağlı PDMS cihazını deiyonize suya yerleştirin ve cihazın mikro kanalından havayı çıkarmak için kabı 15 dakika boyunca vakum altında bir desikatöre yerleştirin. Cihazdaki tüm hava çıkarıldıktan sonra, PDMS cihazını bir doku kültürü başlığına yerleştirin ve cihazın yüzeyini 30 dakika boyunca sterilize etmek için UV ışığı kullanın. Daha sonra, cihazdaki deiyonize suyu PBS'de% 5 sığır serum albümini ile değiştirin ve cihazı 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

Bu, yüzeyi tıkayacak ve izole edilmiş hücrelerin yakalama kuyularından kültür kuyularına transfer verimliliğini artıracaktır. 30 dakika sonra, cihazdaki blokaj solüsyonunu steril PBS ile değiştirin. Mililitrede 2,5 milyon hücreli tek hücreli bir süspansiyon hazırlayın ve 50 mikrolitre süspansiyonlu bir pipet yükleyin.

Ardından, hücreleri cihazın çıkış deliğinden cihaza aktarın. 50 mikrolitre daha hücre süspansiyonu yükleyin ve tüm mikrokanalı hücrelerle eşit şekilde doldurmak için giriş deliğinden cihaza aktarın. Yüklendikten sonra, cihazın çıkış deliğini kapatmak için bir milimetre çapında naylon misinadan yapılmış steril bir tapa kullanın.

Ardından, bir mililitrelik steril bir şırıngayı kültür ortamı ile doldurun, kalan hava kabarcıklarını çıkarın ve şırınga pompasına yerleştirin. Şırıngaya 23 gauge kör bir iğne bağlayın ve iğneyi cihazın girişine bağlamak için politetrafloroetilen boru kullanın. Tüpü bağladıktan sonra, fişi çıkış deliğinden çıkarın ve hücreler yerçekimi kuvveti ile tek hücre yakalama kuyularına yerleşirken iki dakika bekleyin.

Ardından, şırınga pompasını dakikada 600 mikrolitreye ayarlayın. Çıkış fişini çıkarın ve yakalanmamış hücreleri 30 saniye boyunca yıkayın. Basıncın dengelenmesi için iki dakika bekleyin.

Daha sonra tüpü cihazın girişinden çıkarın ve kapalı bir kültür sistemi oluşturmak için hem giriş hem de çıkış deliklerini tapalarla kapatın. Şimdi, yakalanan tek hücreleri cihazın diğer tarafındaki kültür mikro kuyularına aktarmak için cihazı elle çevirin. Ardından, cihazı 100 milimetrelik bir doku kültürü kabına yerleştirin, cihazın etrafına 10 mililitre sterilize edilmiş PBS ekleyin ve kabı bir inkübatöre yerleştirin.

Kültür ortamını değiştirmek için, mikrokanala hava kabarcıkları girmesini önlemek için önce PDMS cihazının üzerine giriş ve çıkışın yakınına iki damla kültür ortamı yerleştirin. Ardından, PDMS cihazının üstünden mikrokanalın uçlarına yakın iki delik açmak için 0,75 milimetrelik bir biyopsi zımbası kullanın. Cihazın yalnızca üst katmanını deldiğinizden emin olun.

Ardından, önceden ısıtılmış taze ortam içeren bir mililitrelik plastik şırıngayı doldurun ve yeni oluşturulan giriş portuna bağlamak için 23 gauge kör iğne ve PTFE boru kullanın. Eski ortamı değiştirmek için yaklaşık 120 mikrolitre taze ortamı beş dakika boyunca cihaza yavaşça akıtan. Bittiğinde, giriş ve çıkış portlarını iki tapa kullanarak kapatın ve cihazı hücre kültürü inkübatörüne geri koyun.

Yakalama kuyularında sona eren hücre sayısı, hücre tipine bağlı olarak yaklaşık% 68 ile% 85 arasında değişir. Ek olarak, yakalama kuyularının çoğu, hücre tiplerinin üçü için de yalnızca tek bir hücre içerir. Yakalanan KT98 hücrelerinin kültür kuyucuklarına aktarılmasının ardından, kuyucukların yaklaşık %77'sinde sadece tek bir hücre vardı, %16'sında hücre yoktu, %6'sında iki hücre vardı ve kuyucukların %1'inden azında üç veya daha fazla hücre vardı.

Yedi gün boyunca, izole edilmiş tek hücreler heterojen büyüme paternleri sergiledi. Hücrelerin bir kısmı çoğalırken, diğerleri çoğalmadı. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa yaklaşık 20 dakika içinde yapılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, tek hücreli deneylerinizin verimliliğini artırmak için bu yüksek verimli tek hücre izolasyonu endokrin kültür platformunu nasıl kullanacağınızı iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü denerken, hava kabarcıklarının mikrokanala girmesini önlemeyi ve zaman geçtikçe hücrelerin bir araya gelmesini önlemeyi unutmamak önemlidir.