Üç boyutlu Hidrojeller içinde Görüntüleme FRET

Bu deneysel yöntemin genel amacı, doğal dokuları taklit eden üç boyutlu hidrojeller içine gömülü hücrelerin FRET görüntülemesini kullanarak hücre içi sinyallemenin gerçek zamanlı çalışmasını sağlamaktır. Bu yöntem, gelişimsel biyoloji, farmakoloji ve rejeneratif tıp alanında, optimum biyomalzemelerin geliştirilmesi ve tasarlanmış 3D mikro dokularda yüksek verimli ilaç taraması gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, FRET'in geleneksel geniş alan mikroskop sistemleri kullanılarak çok sayıda hidrojel tipinde çok sayıda hücre üzerinde kullanılabilmesidir.

Hidrojel dökümü için kalıplar imal edildikten ve kültürlenmiş hücrelerin hidrojel çözeltisi içinde askıya alınmasından sonra, metin protokolüne göre, bir doku kültürü davlumbazında, öncü içeren hücreyi steril teknik kullanarak döküm kalıplarına ekleyin. Çapraz bağlamadan önce, hücreleri tek bir odak düzlemine hapsederek ve düzlem dışı sinyali en aza indirerek görüntülemeyi optimize etmek için hidrojel öncüsünde asılı hücreleri merkezleyin. Daha sonra, PC hidrojellerini çapraz bağlamak için, öncüyü içeren hücreyi ışınlamak için milimetre kalınlık başına santimetre kare başına 3,2 joule'ye eşit bir maruz kalma süresi için bir UVA ışık kaynağı kullanın.

Alternatif olarak, daha ucuz bir el tipi diş lambası kullanın. Hidrojeli aşırı maruz bırakmaktan kaçının, çünkü bu hücre canlılığını azaltacaktır. Fiziksel olarak çapraz bağlanan hidrojeller bunun yerine 37 santigrat dereceye yerleştirilir.

Çapraz bağlamadan sonra, PDMS hidrojel döküm kalıbını çıkarın ve önceden hazırlanmış PDMS kabı ile değiştirin. PDMS'yi yapıştırmak için camın üzerine bastırmak için steril bir spatula kullanın. Hidrojeli daldırılmış halde tutmak için PDMS kabında oluşturulan kuyucuğa fenol içermeyen serum içermeyen ortam veya kimyasal olarak tanımlanmış bir ortam ekleyin.

Çanağı 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Hidrojel içeren PDMS çanağı mikroskop aşamasına sabitlendikten ve objektife yağ uygulandıktan sonra, görüntüleme için en az 15 hücre bulmak için iletilen ışığı kullanın ve floresan görüntüleme ile transfeksiyonu doğrulayın. Mikroskop yazılımında, görüş alanının merkezine yakın birkaç hücre arasından seçim yaparak FRET görüntü kanalları için kamera ayarlarını yapılandırın ve metin protokolüne göre görüntü kanalı başına pozlamayı ve kazancı optimize edin.

Hidrojelin merkezine yakın, nispeten düz aydınlatma alanı içinde ne çok parlak ne de çok loş olan ve FRET oranı 00 ile 1.0 arasında olan hücreleri seçin. Ardından, en az 15 transfekte hücre için görüntü elde etmek üzere birden çok görünüm alanı seçin. Pozlamayı sınırlamak için işiniz bittiğinde ışığı kapatın.

Zaman atlamalı görüntü alımı için yakalama hızını yapılandırmak için, yakalamaların periyodikliğini girin. Temel sinyal yakalama için görüş alanı başına her beş saniyede bir gibi yüksek bir hız ve sonraki uzun vadeli sinyal kinetiği için daha yavaş bir hız kullanın. Görüntü almayı başlatmak için Şimdi çalıştır'ı seçin ve belirlenen görüş alanında yoklama yanıtı için bir temel oluşturmak üzere beş dakika boyunca görüntü yakalayın.

Beş dakikalık görüntü alımından sonra, istenen agonisti veya antagonisti pipetleyin, pipetleyerek karıştırın ve görüntülemeye devam edin. Metin protokolüne göre FRET kalibrasyonunu gerçekleştirdikten sonra, mikroskop yazılımında arka plan ilgi bölgesi simgesindeki oku seçin ve Eliptik Arka Plan İlgi Bölgesi Çiz'i seçin. Arka plan düzeyini tanımlamak için hücrelerin yakınındaki her görüş alanı için bir ilgi alanı veya ROI çizin ve belirleyin.

Arka Plan Ofsetini Güncellemeye Devam Et'in seçili olduğundan emin olun, ardından İlgilenilen Arka Plan Bölgesi simgesini tıklayarak ilgilenilen arka plan bölgesinin görüntülenmesini etkinleştirin. Alternatif olarak, ilgi bölgesi simgesini seçin ve ilgi bölgesi özelliklerini İlgi Alanı Arka Plan Bölgesi Olarak Kullan olarak ayarlayın ve İlgi alanları her Çoklu Noktada farklıdır. İlgi bölgesi arka plan simgesini kullanarak, İlgi Bölgesini Kullanarak Arka Planı Çıkar'ı seçin.

Açılır pencerede, İlgilenilen Arka Plan Bölgesini Çıkar altında, Her Görüntü'yü seçin ve Şuna Uygula'nın altında Tüm Çerçeveler'i seçin. Her görüş alanı için, alıcı emisyon kanalını ve ikili maskeyi kullanarak hücrenin etrafında bir ilgi alanı tanımlamak için İkili, Eşiği Tanımla menüsünü kullanın ve Geçerli Çerçeveye Uygula'yı seçin. Ardından, hücreleri seçmek için alt eşiği ayarlayın.

Ardından, gerekirse ikili maskedeki delikleri doldurmak için İkili Kapat işlevini kullanın. Ardından, ikili maskeyi ilgi bölgeleri olarak kaydetmek için İlgilenilen Bölge simgesini kullanarak İkili'yi İlgi Bölgesine Kopyala'yı seçin. Sonraki görünüm alanları için ilgi alanlarını varolan ilgi bölgeleri havuzuna ekleyin.

İlgilendiğiniz tüm sahte bölgeleri silin. Ardından, İlgi Bölgelerine sağ tıklayın ve özelliklerinin Standart İlgi Bölgesi Olarak Kullan olduğunu ve İlgi Bölgelerinin her Çoklu Noktada farklı olduğunu kontrol edin. İlgilenilen hücre bölgesi elle çizilebilir, ancak sahte değerlerin çıkarılmasına özen gösterilmelidir.

Protokol, düz aydınlatma alanının dışında kalan hücreler ve düz alanı olmayan mikroskoplar için prosedürler içerir. Jelleşmeden önce hidrojel öncülerinin santrifüjlenmesi, lamel yakınındaki bir odak düzlemindeki hücre sayısını en üst düzeye çıkardı. Bu, arka plan gürültüsünü en aza indirdi ve görüntüleme verimini artırdı.

Bu FRET deneyinde, söndürülmüş emisyon veya QE, FRET oranı hesaplaması için, tek zincirli ikili ICUE1 probu için, QE'nin uyarma ve emisyon için CFP CFP'ye eşit olması ve alıcı emisyonun, uyarma ve emisyon için YFP YFP'ye eşit olması dahil olmak üzere yalnızca iki görüntü gerekliydi. Burada gösterildiği gibi homojen aydınlatma alanı içinde birkaç hücrenin bulunduğu çoklu görüş alanları seçildi. Kanal sinyallerinin arka plan düzeltmesi ve hücre analizi için ROI'ler, deneylerin başlangıcından itibaren eşikli alıcı emisyon görüntüleri kullanılarak belirlendi.

Ek olarak, burada gösterildiği gibi, yeterli prob ifade eden hücreler seçildi. Piksel başına QE ve duyarlı emisyon FRET oranları ve hücre başına ortalama FRET oranı hesaplandı. SE oranının tersi hesaplandı ve her iki oran da normalize edildi.

Forskolin stimülasyonu altında, hem QE hem de SE bazlı Fret oranları, kondrositlerde artmış döngüsel AMP aktivitesini tespit eder. Hem fiziksel olarak çapraz bağlanmış hem de kimyasal olarak çapraz bağlanmış jeller, zaman içinde QE FRET oranında bir artış gösterdi, bu da forskolin ilavesine artan bir döngüsel AMP sinyal tepkisini gösterir. Bu prosedür, farklı mikrodoku tipleri arasındaki geçirgenlik ve hücresel tekilleşme farkları nelerdir gibi soruları yanıtlamak için FRAP, flim fret ve fret ve anizotropi ölçümü gibi diğer mikroskopi teknikleriyle birlikte kullanılabilir.

Çapraz bağlama, PDMS'nin yakınında söndürüldüğünden, çap olarak hidrojellerin kendisinden biraz daha büyük olan foto-çapraz bağlama hidrojelleri için kalıpları tasarlamayı unutmamak önemlidir.