Yer Alan Ana Faktörler yüksek verimli tarama mikroskopisi bazlı deneyler Brucella Hela Hücrelerinin Enfeksiyon

Bu yüksek verimli mikroskopi tabanlı testin genel amacı, HeLa hücrelerinin Brucella enfeksiyonunda rol oynayan konak faktörlerini tanımlamaktır. Bu yöntem, hücre içi patojen Brucella tarafından kolonizasyonu teşvik eden veya önleyen konak proteinlerinin tanımlanması gibi, konak patojen etkileşimi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, veteriner laboratuvarından görüntü analizine kadar yarı otomatik iş akışının, robotların ve verimli yüksek verimli deneylerin oluşturulmasına izin vermesidir.

Dolayısıyla bu yöntem, siRNA ekranlarını kullanarak Brucella konak etkileşimleri hakkında bilgi sağlayabilir. Protokolün çoğu diğer tarama stratejilerine uygulanabilir. Örneğin veya siRNA kütüphaneleri.

HeLa hücrelerini kültürledikten ve metin protokolüne göre siRNA'larla tarama plakaları hazırladıktan sonra, 384 oyuklu siyah bir plakayı 300 kez G ve oda sıcaklığında 20 dakika santrifüjleme ile çözdürün. FCS olmadan oda sıcaklığında dmem kullanarak transfeksiyon ortamını hazırlayın. Transfeksiyon reaktifini bir ila 200 oranında seyreltmek ve kullanmadan önce dikkatlice karıştırmak için.

Bir reaktif dağıtıcı kullanarak, 384 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 25 mikrolitre transfeksiyon ortamı ekleyin ve plakayı ileri geri hareket ettirerek çözeltileri karıştırın. siRNA transfeksiyon reaktif kompleksi oluşumuna izin vermek için plakayı oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Bu arada, kültür ortamını aspire ederek ve 75 santimetre karelik bir şişenin alt birleşen hücrelerini bir kez yıkamak için PBS'ye 2.5 mililitre% 0.05 tripsin EDTA ekleyerek HeLa hücrelerini hazırlayın.

Daha sonra 1,5 mililitre taze tripsin ekleyin ve şişeyi, hücreler toplanana kadar iki ila üç dakika boyunca 37 santigrat dereceye aktarın. Hücreleri yeniden süspanse etmek için 10 mililitre önceden ısıtılmış dmem %60 FCS kullanın. Ardından,% 16 FCS ile dmem'de mililitre başına 10.000 hücrelik bir hücre süspansiyonu hazırlamadan önce hücreleri saymak için otomatik bir hücre sayacı kullanın.

Her bir transfeksiyon reaktifi kuyucuğuna 50 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin. Kuyu başına 500 hücre ile sonuçlanır. Hücreleri eşit şekilde dağıtmak için plakayı ileri geri hareket ettirin.

Ardından, hücrelerin yerleşmesini sağlamak için plakayı oda sıcaklığında beş ila 10 dakika bekletin. Plakayı kapatmak için parafilm kullanın. Ve nemli bir inkübatörde önceden ısıtılmış bir alüminyum plaka üzerinde 37 santigrat derece 5 ile% 02 ile 72 saat boyunca inkübe edin.

Üçüncü sınıf patojen B.abortus ile çalışmak tehlikelidir ve koruyucu tulum, koruyucu eldiven, maske ve gözlük takmayı içeren yerel biyogüvenlik düzenlemelerine uyulması gerekir. Enfeksiyondan bir gün önce, önceden belirlenen miktarda B.abortus başlangıç kültürünü 50 mililitre TSB KM besiyerinde aşılayın. 250 mililitrelik vidalı kapaklı bir şişede.

Şişeyi kapatmak için parafilm kullanın ve gece boyunca 37 santigrat derece ve 100 RPM'de bir çalkalayıcı üzerinde 600.8 ila 1.1 optik yoğunluğa kadar bakteri büyütün. Bakteri kültürünün optik yoğunluğunu 600 ölçün. Ve istenen enfeksiyon çeşitliliğini elde etmek için bakteri kültürünü dmem% 10 FCS içinde seyrelterek enfeksiyon ortamını hazırlayın.

Veya, MOI. Otomatik bir plaka yıkayıcı kullanarak, transfeksiyon ortamını 50 mikrolitre enfeksiyon ortamı ile değiştirin. Kaputun içinde, plakayı santrifüj kafesine aktarın ve 384 kuyulu plakayı 20 dakika boyunca 400 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin.

Ardından, plakayı kapatmak için parafilm kullanın ve önceden ısıtılmış bir alüminyum plaka üzerinde 37 santigrat derece ve% 5 C02'de dört saat boyunca inkübe edin. Otomatik plaka yıkayıcı ile inkübasyondan sonra, hücre dışı bakterileri etkisiz hale getirmek için hücreleri yıkamak için mililitre başına 100 mikrogram dentrimysen veya GM içeren% 10 FCS ile dmem kullanın. Ardından, plakayı kapatmak için parafilm kullanın ve son nokta tahlili için 40 saat daha inkübatörde önceden ısıtılmış alüminyum plakaya geri yerleştirin.

Hücreleri sabitlemek için önce kuyuları yıkamak için PBS kullanın. Ardından, PBS'yi 50 mikrolitre% 3.7 PFA ile değiştirin. 2'de pH 7.4'te.

Ve hücreleri oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, fiksasyon ortamını değiştirmek için 50 mikrolitre PBS kullanın. Numuneleri otomatik plaka yıkayıcı ile boyamak için, hücrelere nüfuz etmek için 10 dakika boyunca PBS'de 50 mikrolitre %1 Triton X-100 kullanarak başlayın.

Hücreleri üç kez yıkamak için PBS'yi kullandıktan sonra, mililitre DAPI başına bir mikrogram ile 50 mikrolitre PBS ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Ardından, hücreleri ışıktan korumadan önce üç kez yıkamak için PBS kullanın. Plakayı otomatik mikroskoba aktarın.

Mikroskop parametrelerini ayarlayın. 10-X öznel olanı seçin. Ardından 384 kuyulu plakaya karşılık gelen plaka formatını seçin.

Kuyu başına dokuz site edinin. Lazer tabanlı odaklamayı etkinleştir'i seçin. Ve plakaya ve kuyu dibine odaklanın.

Ardından, numuneyi bulmak için ilk kuyu olarak edinilen ilk kuyuyu ve site otofokusu için tüm siteleri ayarlayın. Ardından, DAPI kanalı için odak için Z ofsetini manuel olarak ayarlayın. Ardından, odağı kuyu dibine ayarlamak için Örnek Bul'a basın.

Otomatik Pozlama işlevini kullanarak pozlama süresi için iyi bir tahmin elde edin. Düşük aşırı pozlama ile geniş bir dinamik aralık sağlamak için DAPI kanalının pozlama süresini manuel olarak düzeltin. Plaka boyunca birkaç bölgeyi görüntülemek için bu pozlama süresini kullanın.

Ve en parlak pikseller siteler üzerindeki maksimum parlaklığın yaklaşık %80'ine ulaşana kadar pozlama süresini manuel olarak ayarlayın. Odak ve pozlama süresini diğer tüm kanallar için uygun şekilde ayarlamak için adımları tekrarlayın. Ardından, tam plakayı almaya başlayın.

Uç nokta tahlili için, tam plakayı görüntülemek için DAPI ve GFP kanallarını kullanın. Uç nokta tahlilinde lekeli hücreler üzerinde bir görüntü analizi çalıştırmak için, bir gölgelendirme modeli hesapladıktan sonra, metin protokolüne göre Çıktı ayarlarını görüntüle altında, görüntülerin bulunduğu giriş klasörünü ve sonuçların bulunduğu bir çıkış klasörünü seçin. Ardından, görüntülerin ortak olduğu metni tanımlayın ve gölgelendirme modellerini yükleyin.

Test modunu başlat'a tıklayın ve tüm modüller için duraklat ve görüntüleme ayarının devre dışı bırakıldığından emin olun. Dokuzuncu modül ImageMath için duraklatma ve görüntüleme ayarını etkinleştirin. Etkinleştirilen duraklatma sembolü sarı renkte görünecektir.

Etkinleştirilen ekran işlevi açık bir göz olarak görünecektir. Ardından, analizi dokuzuncu modüle kadar çalıştırmak için Çalıştır'a tıklayın. Dokuzuncu modülde, parametreyi ayarlayın: ikinci görüntüyü, çekirdekleri bastırmadan Brucella'daki DAPI sinyalini bastıracak bir değerle çarpın.

Modülün değerlerini test etmek için Adım'a basın. Yeni açılan görüntüye sağ tıklayın ve görüntü kontrastını normalleştirilmiş günlüğe ayarlayın. Tekrar tekrar, dokuzuncu modüle geri dönün.

Parametreyi ayarlayın, ikinci görüntüyü ile çarpın ve Brucella sinyali tamamen bastırılana kadar modülün üzerine tekrar basın, aynı zamanda aşırı çıkarmayı gösteren siyah alanlar en aza indirilir. Belirli modüller için iyi parametreler bulmak, parametrelerin kademeli olarak optimize edilmesini gerektirir. Modüllerin üzerinden tekrar tekrar geçmek, farklı değerler denemek ve görüntülenen sonuç üzerindeki etkiyi gözlemlemek kesinlikle önemlidir.

Modül 10 için duraklatmayı ve görüntülemeyi etkinleştirin. Birincil nesneleri tanımlayın. Parametreyi eşik üzerinde alt sınırı, çekirdeklerin bölümlere ayrılması ve arka planın yok sayılması için yeterince yüksek ayarlayın.

İyi bir değer belirlemek için modülün üzerine gelin, ardından giriş görüntüsüne sağ tıklayın ve tepe noktasının tipik olarak arka planı gösterdiği histogramı görüntüleyin. Arka plan yoğunluğundan başlayarak, çıktı görüntüsünde gösterildiği gibi çekirdeklerin iyi segmentasyonu elde edilene kadar parametreyi artırın. Görüntü analizi boru hattının amacı, çoğalan bakteriler içeren hücreleri tanımlamaktır.

Bu, çekirdek, peri-çekirdek ve Voronoi hücre gövdesindeki patojen sinyali için farklı eşikler ayarlanarak elde edilir. Modül 15 için duraklatmayı ve görüntülemeyi etkinleştirin. Nesneleri daha önce gösterildiği gibi filtreleyin ve Çalıştır'a basın.

Parametre minimum değerini, yalnızca çekirdekte açıkça görülebilen Brucella bulunan hücrelerin tutulması ve diğerlerinin filtrelenmesi için yeterince yüksek ayarlayın. İyi bir değer belirlemek için modülün üzerine gelin ve çıktı görüntüsünü görüntüleyin. Sadece çekirdekte açıkça görülebilen Brucella hücreleri tutulana kadar değeri kademeli olarak artırın.

Metin protokolüne göre 16 ve 17 numaralı modüllerde peri-çekirdek ve Voronoi hücre gövdesinde bakteri bulunan hücreleri filtreledikten sonra, test modundan çıkın ve modüllerin hiçbirinin ekranlarını göstermediğinden emin olmak için modüllerin yanındaki tüm göz sembollerinin işaretini kaldırın. Son olarak, analizi başlatmak için Görüntüleri Analiz Et'e basın. Analiz bittiğinde, analizin plaka boyunca güvenilir bir şekilde çalıştığından emin olmak için elde edilen PNG görüntülerini ve CSV elektronik tablosunu inceleyin.

Giriş testini ve enfeksiyon puanlamasını metin protokolüne göre gerçekleştirin. Bu şekil, uç nokta tahlilinde enfekte olmuş hücreleri otomatik olarak tanımlamak için kullanılan bir görüntü analizi örneğini göstermektedir. DAPI ile boyanmış çekirdek HeLa hücreleri tanımlandı.

Çekirdeği çevreleyen sekiz piksel genişliğinde bir peri-çekirdek. Ve çekirdeğin 25 piksel uzamasıyla bir Voronoi hücre gövdesi hesaplandı. Patojen sinyali en az bir bölmede karşılık gelen eşiği aşarsa, bir hücre enfekte olarak kabul edildi.

Brucella, konakçı hücrelerin başarılı bir şekilde devreye girmesi için yeniden düzenlemeler gerektirir. Bu nedenle, ARP23'ün tükenmesi, siRNA taraması için uygun bir pozitif kontroldür. ARPC3'ün tükenmesi, enfeksiyondan iki gün sonra çoğalan bakterilerin bulunduğu hücre sayısını azalttı.

Karıştırılmış tedavi edilmiş kontrollü hücrelerle karşılaştırıldığında. Otomatik görüntü analizi, bu grafikte kontrollü hücrelere kıyasla ARPC3 tükenmiş HeLa hücrelerinin enfeksiyonunda nicel olarak azaldığı gözlemlenmiştir. ARPC3'ün tükenmesi, kontrollü hücrelere kıyasla giriş testinde Brucella enfeksiyonunda bir azalma olduğunu da gösterdi.

Görüldüğü gibi hücre içi Brucella sayısının azalması sarı renkle gösterilmiştir. Son olarak, otomatik görüntü analizi ile enfeksiyonun ölçülmesi, enfekte hücrelerin sayısının yanı sıra enfekte hücrelerdeki hücre içi bakteri sayısının ARPC3'ün tükenmesiyle azaldığını doğruladı. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu protokol deneye başladıktan sonraki bir buçuk hafta içinde görüntü analizi sonuçları verebilir.

Bu prosedürü denerken, seçilen parametrelerin tam plaka boyunca iyi performans gösterdiğinden emin olmak için görüntü analizi sonuçlarını dikkatlice gözden geçirmek önemlidir. Bu prosedürü takiben, ek soruları yanıtlamak için yaşam hücresi görüntüleme gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Trafik ticareti yaparken olduğu gibi, belirli bir ana bilgisayar faktörü Brucella ile etkileşime girer.

Ya da bir genin tükenmesinin enfeksiyonun hücre içi dinamiklerini nasıl etkilediği. Geliştirildikten sonra, bu teknik, enfeksiyon biyolojisi alanındaki araştırmacıların bir HeLa hücre tahlilinde Brucella enfeksiyonu için gerekli konak faktörlerini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, HeLa hücrelerinin hücre içi patojen Brucella abortus tarafından başarılı bir şekilde kolonizasyonunu teşvik eden veya önleyen konak faktörlerini nasıl tanımlayacağınızı iyi anlamış olmalısınız.

Brucella abortus ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve yerel biyogüvenlik düzenlemelerine kesinlikle uyulması gerektiğini unutmayın.