Gap Junctional Hücreler arası iletişim: Doğal Ürünler Toksikantların ve Toksinler Yan Etkileri değerlendirmek için Fonksiyonel Biyomarker ve Sağlık Faydaları
25 Aralık 2016
Bu protokol gap junction kanalları aracılığıyla arası iletişimi ölçen bir neşter yükleme-floresan boya aktarımı teknik anlatılmaktadır. Gap Junctional hücrelerarası iletişim doku homeostazı korunur ve bu hücre sinyal bozulması olumsuz sağlık etkileri vardır edildiği önemli bir hücresel bir süreçtir.
Genel amaç, geniş bir yelpazede in vitro farmakolojik ve toksikolojik ihtiyaçlara hizmet edebilen bir memeli hücresi popülasyonu aracılığıyla boşluk, bağlantı, hücreler arası iletişimi ölçmek için basit bir test sağlamaktır. Bu yöntem, bir bileşiğin bir dokunun gelişimini veya bakımını etkileyip etkilemediği gibi toksikoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, toksik maddelere ve toksinlere yanıt olarak geniş bir hücre popülasyonunda boşluk bağlantı fonksiyonunun basit ve hızlı bir değerlendirmesini sunmasıdır.
Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir lisans araştırma görevlisi olan Ajna Uzuni olacak. Deneye başlamak için, Eagle'ın modifiye edilmiş ortamı ve% 5 fetal-sığır serumu içeren 35 milimetre çapındaki kültür plakalarına beşinci WB-F344 sıçan karaciğer epitel hücrelerini üç kez 10 kez tohumlayın. Hücreleri bir inkübatörde %100 birleşime ulaşana kadar kültürleyin ve hücrelerin deneysel tedavisine devam edin.
Doz-yanıt deneylerine devam etmek için, 10 mikrolitre ve 20 mikrolitre önceden hazırlanmış,% 100 asetonitril içinde iki milimolar stok fenantren çözeltisi ve dört mikrolitre, altı mikrolitre ve sekiz mikrolitre 20 milimolar stok fenantren çözeltisi% 100 asetonitril içinde% 100 eklenen stok çözeltisi hacmi için iki mililitre büyüme ortamı içeren üç hücre plakasına. Daha sonra, araç kontrolü olarak hizmet etmek üzere eklenen her hacim asetonitril çözeltisi için iki mililitre büyüme ortamı içeren üç hücre plakasına dört mikrolitre, altı mikrolitre, sekiz mikrolitre, 10 mikrolitre ve 20 mikrolitre% 100 asetonitril çözeltisi ekleyin. Asetonitrili ekledikten sonra plakaları inkübe edin.
Zaman tepkisi deneylerini gerçekleştirmek için, her zaman noktası için iki mililitre büyüme ortamı içeren üç hücre plakasına% 100 asetonitril içinde 20 milimolar stok fenantren çözeltisinden yedi mikrolitre ekleyin. Daha sonra, araç kontrolü olarak hizmet etmek için her zaman noktası için iki mililitre büyüme ortamı içeren üç hücre plakasına yedi mikrolitre% 100 asetonitril ekleyin. Belirlenen her zaman noktası için plakaları inkübe edin.
Ortamı nazikçe dökerek kültür ortamını atın. Hücreleri üç mililitre PBS ile durulayın ve durulamalar arasında boşaltın veya aspire edin. PBS'de çözünmüş mililitre başına bir mililitre bir miligram olan lucifer sarı boyayı her hücre plakasına pipetleyin.
Neşteri işaret parmağı ile başparmak arasında sıkıştırarak boyayı hücrelere önceden yükleyin. Neşteri kültür plakasının kenarına dik ve beş milimetre uzağa yerleştirin ve ardından neşterin bu dik açıdan 15 derecelik bir açıyla nazikçe yuvarlanmasına izin vermek için yerçekimini kullanın. Bıçağı, toplam plakanın üç farklı bölgesindeki bir hücre popülasyonu boyunca yuvarlayın.
Daha sonra, hücreleri LY çözeltisi ile oda sıcaklığında üç dakika inkübe edin. LY'yi boşaltın veya aspire edin ve tüm hücre dışı boyayı çıkarmak ve ekstra hücresel arka plan floresansını ortadan kaldırmak için hücreleri durulayın. Ardından, hücreleri sabitlemek için 0.5 mililitre% 4 fosfat tamponlu formalin çözeltisi ekleyin.
200x büyütmede bir epifloresan mikroskobu kullanarak sabit hücreleri görüntüleyin. Tüm plakaları, girinti çizgisi yatay görüş alanına paralel olacak şekilde hizalayın. Artan dozlarda fenantren ile tedavi edilen WB-F344 sıçan karaciğer epitel hücrelerinin bir dizi SL-DT görüntüsü oluşturuldu.
Lucifer sarı floresan boya göçündeki azalma, artan fenanttren dozlarından kaynaklanır ve bu da boşluk bağlantısal hücreler arası iletişimin veya GJIC'nin artan toksik madde kaynaklı inhibisyonunu gösterir. SL-DT görüntülerinden elde edilen kontrol fraksiyonunun veya FOC değerlerinin ortalaması alındı, istatistiksel olarak analiz edildi ve ardından grafiklendirildi. Bu prosedürü takiben, ek soruları cevaplamak için tek transdüksiyon proteinlerinin western blotları gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.
Mesela, bu bileşikler hücre perforasyonunun mitojenik olaylarını aktive ediyor mu?
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, gap junction (geçiş bağlantısı) kanalları aracılığıyla hücreler arası iletişimi ölçen bir skalpel yükleme-floresan boya transfer tekniğini açıklamaktadır. Bu yöntem, doku homeostazının anlaşılması için kritik öneme sahip olan memeli hücrelerdeki gap junctional hücreler arası iletişimi değerlendirmek için basit bir analiz sağlar.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Toksikoloji
Arka Plan
- Gap junctional hücreler arası iletişim, doku homeostazının korunması için gereklidir.
- Bu iletişimin bozulması, olumsuz sağlık etkilerine yol açabilir.
- Bu teknik, gap junction fonksiyonunun hızlı bir şekilde değerlendirilmesine olanak tanır.
- Çeşitli farmakolojik ve toksikolojik çalışmalarda uygulanabilir.
Çalışmanın Amacı
- Bileşiklerin gap junctional hücreler arası iletişimi üzerindeki etkilerini ölçmek.
- Doku gelişimi ve korunmasını değerlendirmek için güvenilir bir yöntem sağlamak.
- Toksinlerin hücresel iletişim üzerindeki etkisine ilişkin toksikoloji araştırmalarını kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- WB-F344 sıçan karaciğer epitel hücrelerini kültür plaklarına ekleyin.
- Hücreleri %100 konfluense ulaşana kadar kültüre edin.
- Hücrelere deneysel işlemleri uygulayın.
- Hücreler arası iletişimi değerlendirmek için floresan boya transferini kullanın.
Ana Sonuçlar
- Bu teknik, geniş hücre popülasyonlarında gap junction (geçiş bağlantısı) fonksiyonunun değerlendirilmesine olanak tanır.
- Toksik maddelerin hücreler arası iletişimi nasıl etkilediğine dair bilgiler sağlar.
- Çeşitli in vitro çalışmalarda etkinliği kanıtlanmıştır.
- Hızlı ve basit protokol, araştırma verimliliğini artırır.
Sonuçlar
- Bu yöntem, toksikolojik araştırmalar için değerli bir araçtır.
- Gap junctionların doku sağlığındaki rolunun anlaşılmasına yardımcı olur.
- Gelecekteki çalışmalar, yöntemin farmakolojideki uygulamalarını genişletebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Gap junctional hücreler arası iletişim (GJIC), toksik maddelerin doku homeostazı bozulmasını değerlendirmek ve doğal ürünlerin koruyucu etkilerini belirlemek için fonksiyonel bir biyobelirteç görevi görür. Skalpel yükleme-floresan boya transferi (SL-DT) tekniği, GJIC inhibisyonunun popülasyon düzeyinde hızlı bir şekilde değerlendirilmesine olanak tanıyarak erken keşif aşamasındaki mekanistik risk azaltma çalışmalarını destekler. Bu analiz, organ fonksiyonları için kritik olan hücresel iletişim yolları üzerindeki etkilerine göre bileşiklerin önceliklendirilmesi için öngörücü güven sağlar.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Bileşik maruziyetini, bir toksisite mekanizması olarak GJIC bozulmasıyla ilişkilendirerek terapötik hipotezleri sorgular.
- Operasyonel Değer: Canlı hücre popülasyonlarında hücreler arası kanal aktivitesinin doğrudan ölçümü yoluyla fonksiyonel hedef doğrulamasını sağlar.
- Öngörücü Değer: Doku sürdürülebilirliği ve homeostaz üzerindeki yan etkilerin erken biyobelirteçlerini tanımlayarak portföy önceliklendirmesini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Temel GJIC yetkinliğini belirleyerek, onaylanmış biyolojik sistemleri sonraki iş akışları için hazırlar.
- Operasyonel Değer: Otomasyona ve yüksek kapasiteli görüntülemeye uygun, standardize edilmiş ve kantitatif boya transferi okumaları sağlar.
- Ölçeklenebilirlik: in vivo doku kesitleri için uyarlanmıştır ve örnek kapasitesini artırmak amacıyla otomatik floresan mikroskobisine uygundur.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Türler arası korunmuş GJIC mekanizmaları aracılığıyla keşif bulgularını preklinik doğrulamaya bağlar.
- Mekanistik Risk Azaltma: Gözlemlenen fenotiplerin, hedef dışı etkilerden ziyade bozulmuş hücreler arası iletişimden kaynaklanıp kaynaklanmadığını netleştirir.
- Riski Ayarlanmış Kararlar: GJIC modülasyonundaki yapı-aktivite ilişkilerini nicelendirerek ilerleme kriterlerini bilgilendirir.
İşlem Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
SL-DT analizi, yüksek doku bozulma riski taşıyan bileşikleri filtrelemek amacıyla, optimize edilecek öncü bileşik belirleme aşamasından önce mekanik içgörü sağlayan bir keşif aşaması aracı olarak işlev görür.
- Keşif Biyolojisi: Toksik maddelerin veya doğal ürünlerin hücreler arası sinyal ağlarını nasıl değiştirdiğini nicelleştirerek hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Doku düzeyindeki iletişimi yansıtan, popülasyon tabanlı ve tekrarlanabilir fonksiyonel okumalar aracılığıyla analiz hazırlığı sağlar.
- Analitikler: Dozlar ve zaman noktaları arasında istatistiksel karşılaştırmaya olanak tanıyan kontrol fraksiyonu (FOC) değerleri üretir.
- Translasyonel Araştırma: Preklinik modellerde GJIC fonksiyonunu doku bütünlüğü sonuçlarıyla ilişkilendirerek biyobelirteç stratejileriyle uyum sağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Toksikoloji, farmakoloji ve nutrasötik geliştirme programları genelinde yeniden kullanılabilir bir platform görevi görür.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Gap junction kanal aktivitesinin doğrudan fonksiyonel okumasını sağlayarak mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Basit bisturi yüklemesi ve sabit uç noktalı görüntüleme yoluyla standardizasyon ve tekrarlanabilirlik sağlar.
- Stratejik Değer: Erken GJIC bozulmasını, downstream olumsuz doku etkileriyle ilişkilendirerek go/no-go kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Hücreler arası iletişim homeostazını koruyan bileşikleri tanımlayarak riskle uyumlu önceliklendirmeye olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Hücre kültürü, floresan boya kullanımı ve epifloresan mikroskopi konularında uzmanlık gerektirir.
- Güvenilir boya transferi için standartlaştırılmış bisturi tekniğine ve tutarlı inkübasyon sürelerine bağlıdır.
- Görüntü analiz eşikleri ve morfometrik parametreler konusunda ekipler arası mutabakat gerektirir.
- Yükleme ve fiksasyon parametrelerinin optimizasyonu ile farklı memeli hücre tiplerine ve doku kesitlerine uyarlanabilir.
- Yalnızca fonksiyonel kanal aktivitesinin değerlendirilmesiyle sınırlıdır; konneksin ekspresyonu, fosforilasyonu veya kapı durumları arasında ayrım yapmaz.
