Hassas immünohistokimyasal sitozin Modifiye Formlar Algılama

Bu immünokimyasal protokolün genel amacı, peroksidaz konjuge ikincil antikorların ve tiramid sinyal amplifikasyonunun kullanımına dayalı olarak çeşitli doku ve hücresel bağlamda modifiye edilmiş sitozin formlarının mekansal dağılımını değerlendirmektir. Bu yöntem, modifiye edilmiş sitozin formlarının biyolojik işlevini anlamak için gerekli mekansal bilgiyi sağlamayan diğer tekniklerin sınırlamasının üstesinden gelir. Ek olarak, bu yöntem, modifiye edilmiş sitozin formlarının protein soy belirteçleri ile birlikte saptanmasına izin verir ve nükleer lokalizasyonlarını incelemek için kullanılabilir.

Bu işleme başlamak için, vahşi tip CD1 fare embriyolarının ve yetişkin beyin dokularının rehidre doku bölümlerini, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca buz gibi soğuk% 4 PFA veya% 4 FA'ya yerleştirerek düzeltin. Ardından, bölümleri PBS'de oda sıcaklığında beş dakika yıkayarak fazla fiksatifi çıkarın. Daha sonra, doku kesitlerini oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBX ile doldurulmuş bir Coplin kavanozuna yerleştirerek geçirgen hale getirin.

Daha sonra, bölümleri PBT'de kısa bir süre yıkayarak fazla PBX'i çıkarın. Şimdi, geçirgen bölümleri DNA depurinasyonu için oda sıcaklığında 60 dakika boyunca 2 N HCl'ye yerleştirin. Ardından, HCl'yi nötralize etmek için bölümleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 10 milimolar Tris-Hcl'ye aktarın.

Alternatif olarak, bölümleri PBS'de her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Bölümleri PBT'de oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Bundan sonra, sıvıyı doku bölümlerini çevreleyen alandan dikkatlice çıkarın.

Bu arada, doku bölümlerini nemli tutun. Bölümleri dokunmadan çevrelemek için hidrofobik bir bariyer kalemi kullanın. Daha sonra, bölümleri nemli bir odada oda sıcaklığında bir saat boyunca 100 mikrolitre bloke edici çözelti içinde inkübe edin.

Daha sonra, doku bölümlerini 100 mikrolitre bir fare monoklonal anti-5hmC primer antikorunun 1: 5000 seyreltilmesinde ve bir tavşan poliklonal anti-5caC primer antikorunun 1: 1000 seyreltilmesinde oda sıcaklığında bir saat boyunca bloke edici çözelti içinde inkübe edin. Alternatif olarak, inkübasyonu gece boyunca dört santigrat derecede gerçekleştirin. Daha sonra, PBT ile doldurulmuş bir Coplin kavanozundaki bölümleri oda sıcaklığında her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayarak fazla antikorları çıkarın.

Ardından, fazla PBT'yi çıkarın ve gerekirse, PBT hidrofobik bariyeri zayıflatabilecek deterjan içerdiğinden, bölümleri tekrar hidrofobik bir bariyer kalemle çevreleyin. Bunu takiben, bloke edici çözeltide 1:400 oranında keçi anti-tavşan HRP konjuge antikor seyreltmesi ve 1:400 oranında eşek anti-fare 555-konjuge antikor seyreltmesi yapın. Daha sonra doku bölümlerini 100 mikrolitre ikincil antikor karışımında nemli bir odada oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.

Daha sonra, doku bölümlerini PBT ile doldurulmuş bir Coplin kavanozunda her biri oda sıcaklığında beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Daha sonra doku bölümlerini, oda sıcaklığında iki dakika boyunca tiramid sinyal amplifikasyon tamponunda 1:200 seyreltmede 100 mikrolitre tiramide aktarın. Kuluçka süresi, tiramid çözeltisinin, sinyal yoğunluğu ile tiramid bazlı sinyal amplifikasyonunun süresi arasında doğrusal bir ilişkinin gözlemlendiği her bir tiramid sinyal amplifikasyon kiti partisi için deneysel olarak optimize edilmesi gerektiğiydi.

Hemen ardından, slaytları PBT'de her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayarak fazla tiramid solüsyonunu çıkarın. Fazla PBT'yi dikkatlice çıkarın ve bölümleri hemen bir damla montaj ortamı ile kaplayın. Doku bölümlerine nazikçe bir kapak fişi yerleştirin ve kapak fişini oje ile kapatın.

Daha sonra mikroskobik incelemeden önce doku kesitlerini birkaç saat boyunca dört santigrat derecede tutun. Beyin dokusu kesitlerinde 5hmC'nin dağılımını belirlemek için, bu epigenetik modifikasyonun birlikte tespiti, post-mitotik nöronlar için bir belirteç olan NeuN ile birlikte tespit edildi. İmmünohistokimyasal analiz, belirgin 5hmC boyanmasının NeuN-pozitif hücrelerle kolokalize olmasına rağmen, NeuN-negatif glial hücrelerin daha düşük genomik 5hmC seviyelerine sahip olduğunu ortaya koydu.

Nöral kök hücrelerin farklılaşmasında 5caC'nin dağılımını belirlemek için, bu markörün birlikte boyanması, glial farklılaşmanın indüksiyonundan üç gün sonra nöral kök hücrelerin sabit kültürleri üzerinde bir glial markör olan GFAP ile gerçekleştirildi. Nöral kök hücrelerden veya olgun astrositlerden farklı olarak, GFAP eksprese eden hücrelerin büyük bir kısmında güçlü 5caC sinyali gözlenmiştir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa yaklaşık sekiz saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, numunelerinizle birlikte tüm reaktifleri ve malzemeleri hazır bulundurmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, modifiye edilmiş sitozin formlarının nükleer dağılımı hakkında ek soruları yanıtlamak için konfokal görüntüleme yapılabilir. Bu, potansiyel biyolojik işlevlerinin deşifre edilmesine katkıda bulunabilir.

2 N Hcl ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken güvenlik kabini ve koruyucu giysi gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.