Endoplazmik retikulum ve mitokondri Etkileşimleri Çalışma ile In Situ Proximity ligasyon Testi Sabit Hücrelerde
10 Aralık 2016
Burada, sabit hücrelerde endoplazmik retikulum ve mitokondri arasındaki endojen etkileşimleri görselleştirmek ve yüksek hassasiyet ile ölçmek için bir prosedür açıklanmaktadır. Protokol, bir mitokondri ilişkili zar arayüzünde inositol 1,4,5-trifosfat reseptörü / glukoz-regüle proteini 75 / voltaj bağımlı anyon kanalı / siklofilin D kompleksi hedefleyen in situ yakınlık ligasyonu deneyinde optimize özellikleri.
Bu deneyin genel amacı, sabit hücrelerde in situ yakınlık ligasyon testi kullanarak endoplazmik retikulum mitokondri etkileşimlerini görselleştirmek ve ölçmektir. Bu yöntem, basit bir immünofloresan tekniği kullanarak sabit hücrelerdeki ER mitokondri etkileşimlerini daha iyi analiz etmek için biyomedikal alandaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Umarım yeni tedavi stratejileri önerir. Bu tekniğin temel avantajı, sabit hücrelerde ER mitokondri etkileşimlerini görselleştirebilmemiz ve ölçebilmemiz ve bu tekniğin hastaların parafine gömülü doku biyopsilerine uygulanabilmesidir. Bu videoda gösterilen in situ yakınlık ligasyon testini kullanarak, dış mitokondriyal membranda VDAC1'e karşı yönlendirilmiş bir fare birincil antikoru ve endoplazmik retikulum zarında IP3R1'e karşı yönlendirilmiş bir tavşan birincil antikoru, mitokondriyal ilişkili membran arayüzünde yakınlıktaki epitoplarına birleşir. DNA uç kuyrukları bağlı olan ve fare ve tavşan IgG'ye karşı yönlendirilen yakınlık ligasyon probları eklenir ve konektör oligolarının ligasyonu için şablonlar oluşturabilir ve Texas Red Oligonükleotidler kullanılarak amplifiye edilebilir ve görselleştirilebilir. Her iki organel zarı arasındaki mesafe ile uyumlu olarak, mitokondriyal ilişkili zar arayüzünde. Yerinde yakınlık ligasyon testi için hücreleri sabitlemek ve bloke etmek için, kodlanmamış 35 mm cam alt çanak başına 150.000 hücrede insan H7 hücrelerini plakalayın. Ertesi gün, kültür ortamını çıkarın ve hücreleri yıkamak için 1 mL PBS kullanın. Daha sonra tamponu aspire edin ve 1 mL yüzde on formaldehit ekleyin. Hücreleri sabitlemek için plakaları oda sıcaklığında 10 dakika çalkalayarak inkübe edin. Reaksiyonu durdurmak için 1 mL 1 M glisin ekleyin ve plakaları döndürerek karıştırın. Glisin çözeltisini çıkarın ve 1 mL 1XPBS ekleyin. Ardından, plakaları kısaca çalkalayın ve tamponu aspire edin. Daha sonra, hücrelere 1 mL 100 mM glisin ekleyin. Plakaları oda sıcaklığında 15 dakika çalkalayarak inkübe edin. Çözeltiyi aspire ettikten sonra, PBS'ye 1 mL %0.1 triton-X100 ekleyerek hücrelere geçirgen hale getirin. Ve inkübasyonu tekrarlayın. Deterjanı aspire edin ve hücreleri yıkamak için 1 mL PBS ekleyin. Tamponu çıkardıktan sonra, her bir hücre kabına 40 mikrolitre bloke edici çözelti ekleyin ve numuneleri 37 santigrat derecede nemli bir odada 30 dakika inkübe edin. Ardından, slaytların kurumasına izin vermeden her slayt için eşit hacimde artık tampon elde etmeye çalışarak engelleme solüsyonunu bulaşıkların üzerine hafifçe vurun. Yakınlık ligasyon testini gerçekleştirmek için, birincil antikorları seyreltmek için PBS kullanın. Vorteks ve çözeltiyi bulaşıklara ekleyin. Numuneleri 4 ° C'de inkübe edin
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, fikslemiş hücrelerde endoplazmik retikulum ile mitokondriler arasındaki etkileşimlerin yüksek hassasiyetle görselleştirilmesi ve nicelendirilmesi için bir prosedür sunmaktadır. Yöntem, mitokondri ile ilişkili membran arayüzündeki spesifik protein komplekslerini hedeflemek için optimize edilmiş bir in situ yakınlık ligasyon analizi (proximity ligation assay) kullanmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre Biyolojisi
- Nörobilim
- Biyokimya
Arka Plan
- Endoplazmik retikulum ve mitokondriyalar, hücresel metabolizmada kritik roller oynar.
- Bu organeller arasındaki etkileşimleri anlamak, hücresel fonksiyonların aydınlatılması için temeldir.
- Yakınlık ligasyon analizleri, protein etkileşimlerini incelemek için hassas bir yöntem sunar.
- Bu çalışma, söz konusu etkileşimlerde yer alan spesifik bir protein kompleksine odaklanmaktadır.
Çalışmanın Amacı
- ER-mitokondri etkileşimlerini görselleştirmek için bir yöntem geliştirmek.
- Bu etkileşimleri yüksek hassasiyetle nicelleştirmek.
- Hücresel metabolizma ve sinyal iletimi konusundaki anlayışı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- In situ yakınlık ligasyon analizi
- İnositol 1,4,5-trifosfat reseptörünün hedeflenmesi
- Glukozla düzenlenen protein 75'in katılımı
- Voltaj bağımlı anyon kanalı ve siklofilin D kompleksinin analizi
Ana Sonuçlar
- ER-mitokondri etkileşimlerinin başarılı bir şekilde görselleştirilmesi.
- Membran arayüzündeki protein komplekslerinin nicelendirilmesi.
- Etkileşimlerin tespitinde yüksek hassasiyetin gösterilmesi.
Sonuçlar
- Geliştirilen protokol, hücresel etkileşimlerin detaylı bir şekilde incelenmesine olanak tanır.
- Elde edilen bilgiler, metabolik süreçlerin anlaşılmasına katkıda bulunabilir.
- Bu yöntem, çeşitli biyolojik araştırma alanlarına uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Endojen ER-mitokondri etkileşimlerinin nicelleştirilmesi, hücresel sinyal iletimi ve metabolik düzenleme ile ilgili erken keşif hipotezlerinin risklerini azaltmak için kritik öneme sahiptir. In situ yakınlık ligasyon analizi, protein aşırı ekspresyonuna gerek kalmadan organel temas bölgelerinin hassas ve çoklu tespitini sağlayarak, hastalıkla ilişkili sistemlerde prediktif güveni destekler. Bu yetenek, hedef doğrulaması ve mekanistik yolak analizinin kesişim noktasındaki portföy kararlarını güçlendirir.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Validasyonu
- ER-mitokondri temaslarının moleküler düzeyde doğrudan görselleştirilmesine ve miktarının belirlenmesine olanak tanır.
- Fikse edilmiş hücrelerde ve doku biyopsilerinde endojen protein yakınlığını doğrulayarak mekanistik risk azaltmayı destekler.
- Kalsiyum sinyalleme ve organel etkileşimlerini içeren yolaklar için fonksiyonel hedef validasyonunu kolaylaştırır.
- Metabolik ve sinyal iletim bozukluklarında rol oynayan hedeflerin geliştirilmesine yönelik öngörü güvenini artırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Organel altı çözünürlükte protein-protein etkileşimlerini nicelleştirmek için standartlaştırılmış, tekrarlanabilir bir analiz sağlar.
- Bileşiklerin veya genetik perturbasyonların ER-mitokondri temasları üzerindeki etkisini değerlendirmek için çoklu koşullarda test imkanı sunar.
- Deney kolları arasında karşılaştırmalı analize uygun nicel çıktılar sağlar.
- Daha geniş tarama girişimleri için analiz ölçeklenebilirliğini ve platformun yeniden kullanımını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hasta kaynaklı doku biyopsilerinde analize olanak tanıyarak hastalıkla ilgili sistemlerle uyum sağlar.
- Organel etkileşim hedeflerinin keşfinden preklinik doğrulamasına kadar translasyonel sürekliliği korur.
- Yolak katılımına dair mekanistik kanıtlar sunarak risk ayarlı ilerlemeyi destekler.
İş Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu in situ yakınlık ligasyon analizi, fikse edilmiş hücrelerde ve dokularda ER-mitokondri etkileşimlerinin güçlü bir şekilde nicelendirilmesini sağlayarak, erken keşif ile preklinik araştırmalar arasında köprü kurar.
- Keşif Biyolojisi: Organel etkileşim mekanizmaları için hipotez testlerini ve yolak açıklığa kavuşturma çalışmalarını destekler.
- Tarama: Bileşik veya genetik tarama kampanyaları için tekrarlanabilir ve kantitatif okumalar sağlar.
- Analitik: 40 nm altındaki protein yakınlığının hassas tespitini sağlayarak etkileşim frekanslarının istatistiksel karşılaştırmasına imkan tanır.
- Translasyonel Araştırma: Hastalıkla ilişkili örneklerde biyobelirteç hizalamasını ve mekanistik doğrulamayı kolaylaştırır.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla Ar-Ge programı genelinde çeşitli protein etkileşim çalışmaları için yeniden kullanılabilir bir platform sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hedef doğrulamada öngörü güvenini artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Endojen protein etkileşimlerinin tespitini yüksek hassasiyet ve özgüllükle standartlaştırır.
- Stratejik Değer: Sürecin erken aşamalarında sağlam mekanistik veriler sağlayarak daha iyi devam/durdurma kararları alınmasına olanak tanır.
- Portföy Etkisi: Doğrulanmış organel etkileşim profillerine sahip hedeflerin risk ayarlı önceliklendirmesini ve ilerletilmesini destekler.
Uygulama Hususları
- İmmünofloresans ve yakınlık ligasyon analizi protokollerinde uzmanlık gerektirir.
- Yüksek kaliteli antikorlara ve floresans görüntüleme altyapısına erişim gereklidir.
- Çalışmalar arasında tekrarlanabilir nicelleştirme için ekipler arası standardizasyon gerektirir.
- Translasyonel uygunluk için hem hücre hatlarına hem de parafin gömülü doku biyopsilerine uygulanabilir.
- Fikse edilmiş örneklerle sınırlıdır; canlı hücre dinamik etkileşim çalışmaları için uygun değildir.
