Kıkırdak Yenileme için 3D Manyetik Kök Hücre Toplama ve Biyoreaktör Olgunlaşma

Bu manyetik hücre agregasyonu ve dinamik olgunlaştırma yönteminin genel amacı, mezenkimal stromal hücrelerin veya MSC'lerin in vitro kondrojenezini geliştirmektir. Hücre kondansasyonu olarak kondrojenez yerine kök hücrelerin manyetik agregasyonu, kıkırdak rejenerasyon sürecinin erken aşamadaki kritik bir adımıdır. Kök hücreler iskelelerin içine hapsedildikten sonra, hücrelerin dinamik olgunlaşmasını değerlendirmek için iskeleler hücresel biyoreaktöre taşınabilir.

Önemli dinamik yöntemler kas, kalp veya vasküler onarım gibi diğer biyosistemlere de uygulanabilir. Ancak göreceğiniz üzere, bu yöntemler kıkırdak rejenerasyonu için oldukça uygundur. Gerçek bir biyoreaktör kullanılarak yapılan manyetik hücre ekimi ve dinamik hücre olgunlaştırmasının görsel gösterimi kritiktir; çünkü bu iki tekniği yalnızca metin tabanlı talimatlarla öğrenmek oldukça zordur.

Agregat oluşumu için mikromıknatıs düzeneğini kurmak için öncelikle, 6 mm kalınlığındaki bir alüminyum plakadaki her bir 3 cm'lik deliğe 750 µm çapında bir manyetik uç yerleştirin ve plakayı kalıcı bir neodimyum mıknatıs üzerine koyun. İskele ekimi için bir düzenek kurmak amacıyla, öncelikle sert polistireni 2,4 cm²'lik kareler şeklinde kesin ve 1,6 cm²'lik bir yüzeye eşit mesafelerde 3 mm çapında, 6 mm uzunluğunda mıknatıslar yerleştirin. Ardından düzeneği kalıcı bir neodimyum mıknatıs üzerine yerleştirin.

İnsan MSC'lerini etiketlemek için, öncelikle kök hücreleri %90 konfluense ulaşana kadar %5 karbondioksit içeren 37 °C'deki tam MSC büyüme ortamında kültüre edin. Hücreleri aspire edin, ardından glutamin içermeyen Serum üç RPMI ortamı ile durulayın ve hücre kültürü inkübatöründe 30 dakikalık bir inkübasyon için her 150 cm²'lik kültür flaskına 10 mL demir oksit nano partikül çözeltisi ekleyin. İnkübasyonun sonunda, plazma membranına hala tutunmuş olan nano partiküllerin hücre içine alınmasını sağlamak için hücreleri beş dakika boyunca glutamin içermeyen Serum üç RPMI ortamı ile durulayın.

Ardından her bir flasktaki RPMI'yi 25 mililitre komple MSC büyüme medyumu ile değiştirin ve hücreleri gece boyunca hücre kültürü inkübatörüne geri koyun. Ertesi sabah, manyetik hücreleri flask başına sekiz mililitre %0,25 Trypsin-EDTA ile ayırın. Ve ayrıştırılmış hücreleri santrifüjasyon ile toplayın.

Sayım için peletleri süspansiyona getiriyoruz ve her bir manyetik cihazın üzerine cam tabanlı 35 milimetrelik bir hücre kültürü Petri kabı yerleştiriyoruz. Agregatları manyetik olarak oluşturmak için, her Petri kabına üç mililitre kondrojenik ortam ekleyin ve agregat başına 2,5 x 10⁵ işaretli hücre içeren en fazla sekiz mikrolitreyi yavaşça bırakın. Hücrelerin ne çok yavaş ne de çok hızlı bırakılmaması kritik önem taşır.

Manyetizmaya ne çok yakın ne de çok uzak konumlandırın. Tüm agregatlar yerleştirildikten sonra, sferoidlerin oluşması için 20-30 dakika boyunca rahatsız edilmeden bekleyin. Ardından agregatları hücre kültürü inkübasyonuna aktarın.

Aynı gün, 1,5 mL kondrojenik ortam içeren 15 mililitrelik konik tüplerde 2,5 x 10⁵ etiketli kök hücreyi santrifüj ederek agregatlar oluşturun. İskeleleri manyetik olarak ekmek için, her Petri kabına bir adet kurutulmuş pullulan/dekstran polisakkarit gözenekli iskele yerleştirin ve 2 x 10⁶ etiketli hücreyi TGFbeta3 içermeyen 350 µL kondrojenik ortamda seyreltin. Hücreleri dikkatlice iskelelerin üzerine pipetleyin ve hücrelerin tam penetrasyonunu sağlamak için yapıları 37 °C'de inkübe edin.

Beş dakika sonra, Petri kabına yavaşça üç mililitre kondrojenik ortam ekleyin ve hücrelerin iskele gözenekleri boyunca göç etmelerine izin vermek için iskeleleri dört gün boyunca hücre kültürü inkübatörüne geri yerleştirin. Aynı gün, gösterildiği gibi başka bir iskele setine 2 × 10⁶ etiketli kök hücre ekin ve pozitif kontrol olarak üniform şekilde ekilmiş iskeleler elde etmek için hücreleri mıknatıs olmadan inkübe edin. Beşinci günde iskelelerde kondrojenezis için, manyetik cihazı tüm iskelelerden çıkarın ve statik iskeleleri, ortamı haftada iki kez değiştirerek 25. güne kadar hücre kültürü inkübatörüne geri yerleştirin.

Dinamik hücre kültürü için, beşinci günde silikon tüpleri üretici talimatlarına göre uygun uzunlukta kesin ve tüpleri, 500 mililitrelik kültür odasını, iki yönlü döndürücüleri ve kafesleri steril bir mikrobiyolojik güvenlik kabinine yerleştirin. Üretici talimatlarını takip ederek tüpleri, kültür odasındaki iki yönlü döndürücülere bağlayın. Ardından, her bir kafese iki adet hücreleştirilmiş iskale dikkatlice aktarmak için steril bir spatula kullanın.

Tüm iskeleler aktarıldığında, rotasyon sırasında hareket etmelerini önlemek için kapaktaki iğneler aracılığıyla kafesleri yerleştirin. Ardından kültür haznesini kondrojenik besiyeri ile doldurun. Araçların veya iskelelerin kontamine olmasını önlemek için haznelere hazırlık yaparken steril antiseptik teknik kullanın.

Ardından kafesleri hazneye yerleştirin, hazneyi kapatın ve tüpleri kondrojenik besiyeri ile doldurup hava kabarcıklarını gidermek için peristaltik pompayı çalıştırın. Dolu hazneyi biyoreaktör motoruna yerleştirip sabitleyin ve kol ile haznenin dönüşlerini kontrol eden bilgisayarı açın. Daha sonra hem kola hem de hazneye dakikada beş rotasyon hızında bir dönüş uygulayın ve hücreleştirilmiş iskelelerin sürekli beslenmesi için peristaltik pompayı dakikada 10 rotasyon akış hızına ayarlayın.

Sekizinci günde iskele içermeyen bir 3D agregat konstrükt oluşturmak için, sekiz dublet oluşturmak amacıyla iki agregatı kondrojenik ortamda temas ederek füzyonu başlatın. Ardından 11. günde, dört kuadruplet oluşturmak için iki dubletle birleştirme yapın ve 15. günde dört kuadrupleti füzyon ederek nihai yapıyı oluşturun. Manyetik füzyon ile oluşturulan dokular, santrifüjasyon ile elde edilen peletlere kıyasla kollajen II ekspresyonunda anlamlı bir artış göstermektedir.

Aggregant ekspresyonunda artan bir eğilimle birlikte. Hücreleştirilmiş statik iskelelerde, manyetik ekim kullanıldığında, manyetik kuvvetler olmadan ekim yapılan iskeleyle karşılaştırıldığında aggregant ve kollajen II ekspresyonlarında artış gözlemlenir. İlginç bir şekilde, manyetik ekim dinamik diferansiyasyon ile birleştirildiğinde kollajen II ekspresyonu çok daha yüksektir.

Toluidin mavisi kullanılarak yapılan histolojik analiz, 16 agreganın ardışık manyetik füzyonunun bol miktarda glukozamin glikan birikimi sergilediğini ortaya koymaktadır. Ayrıca, manyetik olarak ekilmiş iskelelerde, iskeleler bir biyoreaktörde farklılaştırıldığında glukozamin glikan içeriği, statik olarak kültürlendiklerine göre daha yüksektir. Yöntem kavrandığında, manyetik hücre agregasyonu uygun şekilde gerçekleştirilirse iki saat içinde tamamlanabilmektedir.

Bu prosedürü uygularken, agregat oluşumunu kolaylaştırmak için etiketli hücreleri mümkün olan en küçük hacimde süspanse etmeyi hatırlamak önemlidir. İskelelerin manyetik ekiminin ardından, yeni sentezlenen kondrositlerin ekspresyonunu artırmak için gerçek biyoreaktör kullanılarak dinamik matürasyon gerçekleştirilebilir. Geliştirildiği günden bu yana bu teknik, rejeneratif tıp alanındaki araştırmacıların insanlarda eklem kıkırdağı rejenerasyonunu keşfetmelerine yol açmıştır.

Bu videoyu izledikten sonra; manyetik cihazların nasıl kurulacağı, kök hücre agregatlarından kök hücrelerin nasıl etiketleneceği, iskelelerin manyetik olarak nasıl ekileceği ve gerçek bir biyoreaktörün nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. İnsan hücreleri ve dokularıyla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve her zaman eldiven, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük takmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.