Morfolojik Değişiklikleri Karakterize Eden Bir Protokol Clostridium difficile Antibiyotik Tedavisine Yanıt Vermek

Bu mikrobiyolojik görüntüleme yönteminin genel amacı, farmakolojik tedavinin fenotipik etkilerini ayırt etmek için daha tanımlayıcı bir araç sağlamaktır. Dolayısıyla bu yöntem bulaşıcı hastalıklar alanında gerçekten yardımcı olabilir. Özellikle, bazı antibiyotiklerin morfolojik etkilerine ve C.Difficile'yi nasıl öldürdüğüne bakmak.

Bu tekniğin ana avantajı, farmasötik öldürme eyleminin ayrıntılı bir görünümünü sağlamak için yüksek çözünürlüklü görüntülemeyi in vitro hücre kültürü teknikleriyle birleştirmesidir. Bu tekniğin anlamı, Clostridium difficile enfeksiyonu veya kısaca CDI tedavisine kadar uzanabilir. Bunun nedeni, bu tekniğin bir antibiyotiğin CDI tedavisinde nasıl faydalı olabileceğini belirlemek için bir araç sağlayabilmesidir.

Bu yöntem farmakolojik etki hakkında bilgi sağlayabilse de, karışık kültür modeli veya in vivo hayvan çalışmaları gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Genel olarak, bireyler bu yeni yöntemle mücadele ederler çünkü C.difficile'yi kültürlemek ve bir taramalı elektron mikroskobu kullanmak zordur. Bu yöntem için ilk olarak, farklı antibiyotiklerin etki şekillerini ayırt etmeye çalışırken aklımıza geldi.

Bugün tanışacağınız araştırma ekibiyle sizi tanıştırmak istiyorum. Jahangir Alam bir profesör ve mikrobiyologdur. Bugün göreceğiniz tüm laboratuvar aktivitelerini koordine ediyor.

Tasnuva Rashid, laboratuvarda yüksek lisans öğrencisidir. Günlük mikrobiyolojinin çoğunu yapıyor. Eugenie Bassere doktora sonrası araştırmacıdır.

Tasnuva'ya gerçekten birçok beceri öğretti ve aynı zamanda laboratuvarda yardımcı oluyor. Brad Endres, laboratuvardaki bir başka doktora sonrası araştırmacıdır. Long Chang'ın yardımıyla çok fazla mikroskopi yapacak.

Steril eldiven giyerken ortam izolatları hazırlamak için, zemin, kapı, tutamak veya raf gibi herhangi bir ilgi alanının yüzeyini temizlemek için önceden sterilize edilmiş bir pamuklu gazlı bez kullanın. Ardından swabı sterilize edilmiş bir tüpe yerleştirin. Numuneler arasında eldivenleri değiştirin.

Klinik izolatları hazırlamak için, 10 ila 100 miligram klinik dışkı örneğini sefoksitin, sikloserin, fruktoz, agar veya CCFA üzerine plakalamak için bir aşılama döngüsü kullanın ve örnekleri 48 ila 72 saat boyunca sıkı anaerobik koşullar altında entübe edin. Daha fazla analiz için C.Difficile stoğunun izole edilmiş kolonilerini kriyo şişelerinde eksi 80 santigrat derecede saklayın. Çevresel sürüntü örneklerini beyin kalp infüzyonunda veya BHI suyunda% 05 sodyum taurokolat ile zenginleştirin ve örnekleri beş gün boyunca 37 santigrat derecede anaerobik bir odaya yerleştirin.

Kültürün bir mililitresini 10.000 kez G'de santrifüjleyin ve peleti yeniden süspanse etmek için 100 mikrolitre etanol kullanın. Yeniden süspanse edilmiş hücrelerin 50 mikrolitresini CCFA plakalarına yerleştirin ve kültürleri 40 ila 48 saat boyunca 37 santigrat derecede anaerobik bir odada inkübe edin. Daha fazla analiz için izole edilmiş C.difficile stok kolonilerini kriyo şişelerinde eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Şüpheli C.difficile kolonilerini test etmek için lateks aglütinasyon reaktifini veya PCR'yi kullanın. 48 saat boyunca 37 santigrat derecede anaerobik bir odada kan agar plakaları üzerinde saflaştırılmış çevresel veya klinik C.difficile suşları büyütün. İzole edilmiş bir koloniyi almak için bir aşılama döngüsü kullanın ve 15 mililitrelik bir tüpte beş mililitre BHI ortamına aktarın.

Daha sonra kültürü 24 saat boyunca 37 santigrat derecede anaerobik bir odada büyütün. Ön kültürleri mililitre başına 1 ila 100 ila yaklaşık 10 ila altıncı CFU ile seyreltmek için sodyum taurokolat ve uygun antibiyotik konsantrasyonu ile desteklenmiş taze, önceden indirgenmiş BHIS kullanarak. Bir pipetle, her zaman noktasında bir mililitrelik bir numune toplayın ve plakaya koyun veya küçük bir alikotu bir kan agar plakasına yayın.

Plakayı 37 santigrat derecede anaerobik bir odada 48 saat inkübe edin ve CFU'ları belirlemek için elde edilen koloni sayısını sayın. Mikrosantrifüj tüplerinde her zaman noktasından bir mililitre hücre toplayın ve 10 dakika boyunca 10.000 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücreleri yıkamak için PBS'yi kullanın.

Numuneleri tekrar döndürün ve süpernatanı atın. Daha sonra hücreleri yeniden seyreltmek için bir mililitre% 4 paraformaldehit kullanın ve tüpleri oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Numuneleri tekrar döndürdükten ve süpernatanı attıktan sonra, hücreleri 100 mikrolitre damıtılmış suda yeniden seyreltmeden önce hücreleri iki kez yıkamak için damıtılmış su kullanın.

Çözeltinin bulanıklığına bağlı olarak hacmi ayarlayın. Kapak fişlerini etiketledikten sonra, üzerlerine 40 mikrolitre numune ekleyin. Bir akış başlığı altında, sıvıyı buharlaştırmak ve hücrelerin cama yapışmasını sağlamak için kapak kızaklarını 15 dakika inkübe edin.

Sıvı hala mevcutsa, çıkarmak için bir üfleyici kullanın. Kapak fişlerini bir masa püskürtme makinesine yerleştirin ve bantlayın. Püskürtme makinesinde saf altını sabitleyin.

Ardından makineyi açın ve düşük basınçta püskürtmeye başlayın. Hücreleri 30 saniye boyunca 80 mikroamperde kaplayın, bu da 20 nanometre altın kaplama anlamına gelir. Görüntülemeye başlamak için, önce Havalandırma düğmesine basarak SEM'i bilgisayar yazılımında düzgün bir şekilde havalandırın.

Hücreleri kapladıktan sonra, bunları taramalı elektron mikroskobuna veya SEM'e aktarın. Karbon bandı kullanarak, kaplanmış kapak kızaklarını metal tablaya sabitleyin. SEM havalandırıldıktan sonra, kapı kolayca açılmalıdır.

Metal tablayı vidalayarak SEM odasına kilitleyin. Ardından, tıklayın Pompa yazılımdaki düğmesine basın. Sistem tamam yanıtını verdiğinde SEM kullanıma hazır olacaktır.

Dedektör sekmesi altında, SE dedektörüne tıklayın. Voltajı gösteren düğmeye tıklayarak ışını açın. Voltajı artırmadan önce görüntülemeye daha düşük bir voltajda başlayın.

Işın açıldıktan sonra bir görüntü görünecektir. İzleme işlevini kullanarak, kaplanmış kapak fişleri üzerinde görüntü almak için bir alan bulun. Bölgeyi yakınlaştırın ve Clostridium difficile'yi temsil eden çubuk şeklindeki yapıları bulun.

Sistemi kalibre etmek için yakınlaştırın, görüntüyü kaba bir şekilde odaklayın ve Z'yi serbest çalışma mesafesine bağlayın. Bu, 15, 9 ve 5 milimetre gibi çoklu çalışma mesafelerinde yapılmalıdır. Ardından ultra yüksek çözünürlüklü görüntüleme moduna geçin.

Yüksek büyütme oranında netlemeye başlamak için kaba ve ince netleme düğmelerini kullanın. Daha net bir görüntü için astigmat geçişlerini ayarlayın ve görüntüyü dijital olarak yakınlaştırmak için bilgisayar yazılımını kullanarak görüntünün netliğini kontrol edin. Yüksek kaliteli bir görüntü elde etmek için yavaş taramayı kullanın.

Toplanan görüntüyü daha sonra analiz etmek için bir tiff dosyası olarak kaydedin ve analiz sırasında ölçüm yapılacaksa veri çubuğunun seçili olduğundan emin olun. SEM'de sahneyi eğerek daha fazla derinlik bilgisi ortaya çıkarmak için görüntüleri farklı açılarda toplayın. Yavaş taranan bir görüntüyü toplamadan önce odağı ve astigmatizmayı optimize edin.

Görüntüleme tamamlandıktan sonra, ışını kapatın ve çalışma mesafesini 20 milimetreye yükseltin. Ardından hazneyi havalandırın ve sahneyi çıkarın. Görüntüleri işleyin, görüntü dosyalarını Fiji'de açın.

Çizgi işlevini kullanarak, ölçek çubuğunu hassas bir şekilde izleyin. Analiz sekmesine tıklayın; ardından Ölçek Seç işlevini seçin. Ölçek çubuğuna göre bilinen mesafenin ayarlanmasını gerektiren bir pencere açılacaktır.

Uzunluk birimini de değiştirin ve Tamam'ı tıklayın. Son olarak, hücre uzunluğunu ölçmek için, hücreyi bütünüyle izlemek için çizgi işlevini kullanın. Analiz sekmesini yeniden seçin ve ardından ölç'e tıklayın.

Uzunluk, daha önce belirtilen birimlerde görünmelidir. Bu görüntüler, büyüme eğrisinin üstel fazı sırasında yakalanan C.difficile vejetatif hücrelerinin yanı sıra spor hücrelerini de göstermektedir. Vejetatif hücreler uzun, pürüzsüz, çubuk şeklindeki yapılardır; Oysa sporlar, pürüzlü bir dış yüzeye sahip küçük oval yapılardır.

Bu şekilde gösterildiği gibi, kontrol hücreleri büyür ve bir platoya ulaşır; oysa antibiyotikler vankomisin ve metronidazol ile tedavi edilen hücreler, toplam CFU'larda tespit sınırına kadar azalır ve bu da bakterisidal bir etkiye işaret eder. Gösterildiği gibi, vankomisin ve metronidazol, süper MIC konsantrasyonlarında C.difficile'yi öldürmede etkilidir. C. difficile'yi görüntülemek için SEM kullanmanın faydasını göstermek için, morfolojinin nasıl değiştiğini belirlemek için hücreler ilaç tedavisinden önce ve sonra görüntülendi.

Vankomisin durumunda, hücrelerin duvarlarının bir kısmı etkilenmiş ve metronidazol ile tedavi edilen bazı hücrelerin boyutu daha küçüktü. Hücre boyutunun etkilenip etkilenmediğini test etmek için, hücre uzunluğu Fiji programı kullanılarak analiz edildi. Bu resimde gösterildiği gibi, vejetatif hücre boyutu kontrol durumunda bir miktar değişebilir; Ancak çoğu kabaca 6 mikrometre uzunluğundadır.

Bununla birlikte, bu grafikte gösterildiği gibi, hücre uzunluğu metronidazol ile tedavi edilen hücrelerde etkilenmiştir, ancak vankomisin ile tedavi edilen hücrelerde etkilenmemiştir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik iki günden kısa sürede gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü denerken, kaplama ve görüntülemeden önce numunenizin sabit ve tamamen kuru olduğunu unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, bakterilerin antibiyotik tedavilerine nasıl yanıt vereceği gibi ek soruları yanıtlamak için ek yöntemler uygulayabiliriz; Ve bu bize, örneğin antibiyotiklerin etki mekaniğini anlama konusunda biraz daha fazla fikir verebilir. Bu teknik muazzam bir potansiyele sahiptir ve mikrobiyoloji alanındaki araştırmacıların Clostridium difficile'deki fizyoloji ve farmakolojiyi daha fazla keşfetmelerinin yolunu açabilir. Umarım bugün bu videoyu izlemekten keyif almışsınızdır.

Umarım bundan kazandığınız şey, C. difficile hücrelerinin nasıl büyütüleceği ve karakterize edileceği, C. Difficile'ye karşı antibiyotiklerin öldürme kinetiğine nasıl bakılacağı ve daha sonra bu öldürme modelleriyle ilişkili morfolojik değişikliklerin yüksek seviyeli mikroskopi kullanarak nasıl değerlendirileceğidir. Clostridium difficile ile çalışırken ekstra önlemler almalı ve tüm koruyucu önlemleri kullanmalıyız.