Hücre dışı Matrix Glycoproteomics: Kütle Spektrometresi kullanarak Sağlam GLİKOPEPTİT Analizi için Bir Yöntem

Bu protokolün genel amacı, kardiyovasküler dokularda glikozilasyon bölgelerinin tanımlanması ve glikan formlarının bileşimsel karakterizasyonu dahil olmak üzere hücre dışı matris protein kompozisyonunu analiz etmektir. Bu yöntem, kardiyovasküler hastalıklar sırasında yapısal bir matris glikozilasyonunun doku fibrozisini nasıl etkilediği gibi, doku fibrozisi sürecindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, genel glikozilasyon değişikliklerini analiz eden önceki protokollerin aksine, yapısal matris proteinlerinin belirli bölgelerindeki glikozilasyonun karakterize edilmesine olanak tanıması ve böylece daha hedef odaklı mekanistik takip çalışmaları için bir araç sağlamasıdır.

Prosedürleri laboratuvarımızdan Dr. Marika Fava ve Bayan Ferheen Baig uygulamalı olarak gösterecekler. Bu prosedüre başlamak için, metin protokolünde belirtildiği şekilde tüm ekstraksiyon tamponlarını hazırlayın. Ardından, bir skalpel kullanarak 20 ile 50 miligram dokuyu, yaklaşık iki milimetre boyutunda üç veya dört küçük parçaya bölün.

Küp şeklinde doğranmış dokuyu 1,5 mililitrelik bir tüpe yerleştirin ve 500 mikrolitre buz gibi soğuk PBS ekleyin. Kan kontaminasyonunu minimize etmek için dokuyu, her yıkamada 500 mikrolitre PBS kullanarak beş kez yıkayın. Yıkanmış örnekleri vidalı kapaklı 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve doku ağırlığının 10 katı hacminde sodyum klorür tamponu ekleyin.

Oda sıcaklığında bir saat boyunca minimum hızda vorteksleyin. Ardından, ekstreyi yeni santrifüj tüplerine aktarın ve dört °C'de 10 dakika boyunca 16.000 ×g hızda santrifüjleyin. Elde edilen doku peletlerini taze sodyum klorür tamponu ile kısaca yıkayın.

Bundan sonra, doku ağırlığının 10 katı hacminde SDS tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 16 saat boyunca minimum hızda vorteksleyin. Ekstraktı yeni santrifüj tüplerine aktarın ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 16.000 ×g hızında santrifüjleyin. Elde edilen peletleri çift distile su ile yıkayın.

Doku ağırlığının beş katı hacminde guanidin hidroklorür tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 72 saat boyunca maksimum hızda vorteksleyin. Elde edilen ekstreyi yeni tüplere aktarın ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 16.000 ×g hızında santrifüjleyin. Protein miktarını belirledikten sonra, glikozilasyon bölgesi doluluk oranının değerlendirilmesi için her örnekten 10 µg'ı yeni bir tüpe ve doğrudan glikopeptit analizi için 50 µg'ı ayrı bir tüpe alikotlayın.

Her birine 10 katı hacimde etanol ekleyin ve 20 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, numuneleri 4 °C'de 30 dakika boyunca 16.000 ×g hızda santrifüjleyin. Çöken peleti bozmamaya dikkat ederek süpernatanı aspire edin.

Ardından, peletleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca kurutmak için bir vakum konsantratörü kullanın. Her örneğe 10 µL hazırlanmış deglikozilasyon tamponu ekleyin. Örnek tüplerini 50 mL'lik konik bir tüp içine yerleştirin ve 25 °C'de iki saat boyunca 45 derecelik bir açıyla inkübe edin.

Bundan sonra sıcaklığı 37 °C'ye yükseltin ve hafif ajitasyonla 36 saat boyunca inkübe edin. 16,000 ×g'de bir dakika santrifüj ettikten sonra, suyu buharlaştırmak için oda sıcaklığında 45 dakika boyunca vakumlu konsantratör kullanın. Kurutulmuş örnekleri, 50 units/mL PNGase F içeren 10 µL O-18 işaretli su ile yeniden süspande edin. 37 °C'de sabit ajitasyon altında 36 saat inkübe edin, ardından tüm örnekler için çözelti içi tripsin sindirimi gerçekleştirin ve C-18 temizleme işlemine geçin.

Başlamak için, reçineyi aktive etmek amacıyla C-18 spin plakasının her kuyucuğuna 200 µL metanol ekleyin. 1.000 ×g'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, her kuyucuğa 200 µL suda %80 ACN ve %0,1 TFA ekleyin ve 1.000 ×g'de bir dakika boyunca santrifüjleyin.

Ardından, her bir kuyuya su içerisinde %1 ACN ve %0,1 TFA içeren solüsyondan 200 µL ekleyin ve 1.000 ×g'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Bu solüsyonun eklenmesi ve santrifüjleme işlemini iki kez tekrarlayın. Bundan sonra, örnekleri spin plak kuyuya yükleyin ve 1500 ×g'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Süzüntüyü tekrar yükleyin ve santrifüjleme işlemini tekrarlayın.

Ardından, her bir kuyucuğa su içinde %1 ACN ve %0,1 TFA içeren bir çözeltiden 200 µL ekleyin ve 1500 ×g'de bir dakika boyunca santrifüj edin. Bu çözeltinin eklenmesi ve santrifüjleme işlemini iki kez tekrarlayın. Sonrasında, her bir kuyucuğa su içinde %50 ACN ve %0,1 TFA içeren bir çözeltiden 170 µL ekleyin ve 1500 ×g'de bir dakika boyunca santrifüj edin.

Bu ekleme ve santrifüj işlemini bir kez daha tekrarlayın. Birleştirilmiş elüatı oda sıcaklığında iki saat boyunca kurutmak için vakumlu konsantratör kullanın. Kurutulmuş örnekleri kullanıma hazır olana kadar 80 °C'de saklayın.

Bundan sonra, glikozit doluluk değerlendirmesi yapılacak örnekler üzerinde sıvı kromatografisi tandem kütle spektrometrisi analizi gerçekleştirin. Doğrudan glikopeptit analizi yapılacak örnekler için, öncelikle metin protokolünde belirtilen standart TMT sıfır etiketleme işlemi ile devam edin. Başlamak için, 10 µL'lik her bir TMT sıfır etiketli örneğe, sağlanan bağlanma tamponundan 50 µL ekleyin.

Ardından, homojen gliko yakalama reçine süspansiyonundan 50 µL'lik alikotları yeni 1,5 mL'lik tüplere aktarın ve 2500 ×g'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın ve reçine peletlerini içeren tüplere, karıştırmak için bir pipet kullanarak 60 µL örnek ve bağlama tamponu çözeltisi ekleyin. 1200 RPM'de ajite ederek oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. 2000 ×g'de iki dakika santrifüjlemeden sonra süpernatantı yeni tüplere aktarın.

Bundan sonra, yıkama işlemini başlatmak için pipet kullanarak her bir reçine tüpüne 150 µL yıkama tamponu ekleyip karıştırın. 1200 RPM'de ajite ederek oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. 2500 ×g'de iki dakika santrifüj ettikten sonra, yıkama işlemini tamamlamak için her bir süpernatantı ilgili süpernatant saklama tüpüne aktarın.

Bu yıkama işlemini iki kez daha tekrarlayın. Ardından, 75 µL elüsyon tamponu ekleyin ve bir pipetle karıştırın. 1200 RPM'de ajite ederek oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

2500 ×g'de iki dakika boyunca santrifüjleyin ve her bir süpernatantı yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın. Karıştırmak için bir pipet yardımıyla 75 µL elüsyon tamponu ekleyin ve ardından örneklerin inkübasyon ve santrifüj işlemlerini tekrarlayın. Her bir elüatı ilgili tüpe aktarın.

Birleştirilmiş elüatı 2500 ×g'de iki dakika boyunca santrifüjledikten sonra, reçinenin tamamen uzaklaştırıldığından emin olmak için her bir süpernatantı yeni bir tüpe aktarın. Bunun ardından, elüatı oda sıcaklığında iki saat boyunca kurutmak için bir vakum konsantratörü kullanın. Kurutulmuş glikopeptitleri, çift distile su içindeki %2 ACN ve %0,5 TFA çözeltisinin 15 µL'sinde yeniden süspande edin.

Ardından, metin protokolünde belirtildiği şekilde kütle spektrometrisi analizini gerçekleştirin. Bu çalışmada, kardiyovasküler dokudaki ECM proteinleri, ECM kompozisyonunun yanı sıra indirekt ve direkt glikopeptit analizleri için sıvı kromatografisi tandem kütle spektrometrisi analizine hazırlanır. Temel strateji; sodyum klorür, SDS ve guanidin hidroklorür ile yapılan ardışık inkübasyonların ardından gerçekleştirilen indirekt veya direkt glikopeptit analizine dayanmaktadır.

Ekstraksiyon verimliliği, görselleştirme için gümüş boyama ile bis-tris akrilamid jelleri üzerinde izlenir. Yürütülen üç ekstrakt arasında, ECM glikoproteinlerinin çoğunluğu guanidin hidroklorür alikotlarında görülür. ECM glikoproteinleri, kısa ve çeşitli N ve O-bağlı oligosakkaritlerin yanı sıra büyük ve tekrarlayıcı glikozamin glikan zincirleri ile süslenmiştir.

Deglikozilasyon verimliliği, glikozaminik glikanları sindiren enzimlerin ve daha küçük N ve O-bağlı oligosakkaritleri hedefleyen enzimlerin eklenmesiyle görülür. Glikoproteinler daha sonra NXT veya NXS sekonları içindeki oksijen 18 ile işaretlenmiş deamidasyona uğramış asparaginlerin varlığı ile tanımlanır. İkinci pozisyonda deamidasyona uğramış asparagin içeren bir dekorin peptidinin temsili bir HCD tandem kütle spektrumu burada gösterilmiştir.

Ardından, glikoproteinle zenginleştirilmiş ECM ekstraktını analiz etmek için HCD ETD fragmantasyonu kullanılır. ETD tandem kütle spektrumu, glikan kompozisyonunun karakterizasyonuna olanak tanır. Uzmanlaşıldığında, bu tekniğin yaklaşık iki ila üç hafta sürmesi beklenir.

Bu glikoproteomik yaklaşımı, fibrozis fonksiyonunun fizyolojisini ve patolojisini yalnızca proteomik değişiklikler üzerinden değil, aynı zamanda şeker kompozisyonu üzerinden de keşfetmemize olanak tanır. Bu videoyu izledikten sonra, kütle spektrometrisi ile protein glikozilasyonu çalışması için örneklerin nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu yöntem kardiyovasküler hastalıklar hakkında bilgi sağlayabilse de, solunum yolu hastalıkları veya kanser gibi diğer hacimsel fibrozis patolojilerine de uygulanabilir.