Allojeneik trombosit açısından zengin plazma (PRP) kesitli Aşil tendon sıçan iyileşme süreci üzerine etkileri: metodolojik bir açıklama

Bu prosedürün genel amacı, tek bir Platelet-Rich Plasma (PRP) enjeksiyonunun, cerrahi olarak kesilmiş sıçan Aşil tendonlarının direnci ve iyileşme süreci üzerindeki etkilerini çeşitli zaman noktalarında gözlemlemektir. Bu yöntem, kas-iskelet sistemi alanında tendon lezyonları hakkındaki hızlı soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı; cerrahi, biyomekanik ve PRP ilerleme prosedürlerinin iyi standartlaştırılmış olmasıdır.

Bu tekniklerin etkileri, bu tür lezyonlar ve tendon iyileşme sürecinin sıçanlar ve insanlar arasında benzer olması nedeniyle, PRP'nin insanlarda kullanımına kadar uzanmaktadır. Bu yöntem kas-iskelet sistemi yaralanmaları için PRP hazırlığına dair içgörü sağlayabilse de, bu enjeksiyon tekniği kalp veya cilt hastalıkları gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Cerrahi ve biyomekanik adımların optimal sonuçlar elde etmek için tutarlı bir tekrarlanabilirlik gerektirmesi nedeniyle, yöntemin görsel olarak gösterilmesi oldukça önemlidir.

Sıcağıyla başlayarak sıçanın ağırlığını ölçün ve kulak etiketini takın. Ayak parmağı sıkıştırma yöntemiyle uygun sedasyon seviyesini doğruladıktan sonra, hayvanın kornealarına su damlatın ve sol arka bacağındaki tüyleri temizleyin. Açığa çıkan cildi 1:10 oranında seyreltilmiş iso-Betadine solüsyonu ile dezenfekte edin ve hayvanı, sol arka bacak üstte kalacak şekilde lateral dekubitus pozisyonunda, bir diseksiyon mikroskobu altında 20 °C sıcaklıktaki bir ısıtma pedinin üzerine yerleştirin.

Sol arka ekstremite patisini pensetle kavrayın ve Aşil tendonu çevresine 20 ila 25 milimetrelik lateral bir cilt insizyonu yapın. İnce makaslar kullanarak, Aşil tendonu kompleksini açığa çıkarmak için fasyayı disseke edin ve plantaris tendonunu çıkarın. Aşil tendonunu, kalsaneal insersiyonun 5 mm proksimalinden transvers olarak kesin ve 5 mm uzunluğunda bir parçayı çıkarın.

Ardından, fasyayı ve cildi kapatmak için emilebilir iplik kullanarak süturlara devam edin ve sıçanı, tam iyileşme gerçekleşene kadar izleme altında bir ısı kaynağına yerleştirin. Alıcı hayvanlar iyileşirken, deneydeki her bir hayvan için bir donör sıçan kalbinden 20 mililitre tam kanı, %3,2 tamponlu sodyum sitrat içeren ayrı tüplere toplayın. Trombosit yönünden zengin plazma elde etmek için kanı santrifüjleyin ve üstteki PRP içeren fazı plastik bir transfer pipetiyle dikkatlice ikinci bir plastik tüpe aktarın.

Toplanan PRP hacmini belirleyin ve bir hematoloji analizörü ile trombosit sayısını ölçün. PRP'yi tekrar santrifüjleyin ve süpernatantı dikkatlice yeni bir plastik tüpe aktarın. PRP tüpünde kalan hacim, mikrolitre başına 2,5 x 10⁶ trombosit elde etmek için gereken hacmin yaklaşık 2/3'ü olmalıdır.

Ardından, trombosit pelletini pipetleme yoluyla nazikçe yeniden süspande edin. Bu konsantre trombosit zengin plazmanın trombosit sayısını ölçün ve gerektiğinde hedef konsantrasyona ulaşmak için uygun hacimde otolog trombosit fakir plazma ekleyin. Trombositleri, ml başına 50 microliters kalsiyum klorür kullanarak oda sıcaklığında yaklaşık bir saat boyunca aktive edin.

Ardından trombositleri, 21 gauge iğne takılmış bir mililitrelik bir şırıngaya yükleyin ve her hayvanın sütür bölgesine doğrudan 50 µL trombosit enjekte edin. Uygun deneysel bitiş noktasında, anestezi altındaki deneysel hayvanın sol arka ekstremitesini tıraş edin ve sıçanı az önce gösterildiği gibi bir diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. Patiyi parmaklarınızla tutarak, triceps suralis kasını açığa çıkarmak için cerrahi bölgeye 10 mm'lik bir insizyon yapın.

Aşil tendonunu çıkarmak için, kalsaneal kemiği tutunma noktasının 5 ila 10 mm distalinden transvers olarak kesin ve krio-jaw'a sığacak büyüklükte bir triceps suralis parçası disseke edin. Örneği hemen krio-jaw'ın üst çenesine yerleştirmek için pens kullanın ve cihazı kapatın. Krio-jaw'ı bir üniversal test makinesine dikey olarak yerleştirin ve kalsaneal kemiği alt kıskaçlar arasına sabitleyin.

Kesit alanını hesaplamak için kameraları birbirine dik olacak şekilde yerleştirin. Kasın, çekme testi sırasında deforme olmaması için tendondan çok daha sert bir hale gelmesini sağlamak amacıyla her iki üst çene haznesine de sıvı nitrojen ekleyin. Dondurma bölgesi metal kıskaç sınırına ulaştığında, makinenin yer değiştirme hızını kopma gerçekleşene kadar saniyede bir milimetre sabit hızda ayarlayın ve ultimate çekme dayanımını Newton cinsinden kaydetmek için bir bilgisayar kullanarak çekme testine başlayın.

İyileşen tendonların kesit alanlarındaki farklılıkları hesaba katmak için, nihai çekme dayanımını dokunun maruz kaldığı mekanik stresi temsil eden birim alana normalize edin. Ardından tendon koptuğunda, kopan tendon örneklerini sıvı azot ile hızla dondurun ve RNA ekstraksiyonu ile RTPCR analizine kadar -80 °C'de saklayın. Bu temsilci deneyde, test edilen her zaman noktasında PRP enjekte edilen grupta tendon kopmasını sağlamak için kontrol serum fizyolojik uygulanan gruba göre daha fazla kuvvet gerekmiş olup; bu durum, PRP tedavisi gören hayvanlarda daha güçlü bir iyileşme sürecine veya daha iyi mekanik özelliklere işaret etmektedir.

PRP grubu, salin grubuna göre daha yüksek bir grup içi dağılım göstermiş olsa da, lezyon oluşturulmasını takip eden 15. ve 30. günlerde tendonların kesit alanının PRP enjekte edilen grupta daha geniş olduğu belirlenmiştir. Ayrıca, Masson trikrom boyaması, PRP ile tedavi edilen hayvanlarda 5. ve 15. günlerde tendon morfolojisi ve dayanıklılığının temel bir bileşeni olan fibriler kollajenin daha fazla olduğunu ortaya koymuştur; enjeksiyondan sonraki 30. güne gelindiğinde ise her iki grupta benzer boyama yoğunluğu gözlemlenmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, sıçanlarda standart lezyonların nasıl oluşturulacağı ve PRP enjeksiyonu sonrası iyileşme süreçlerini değerlendirmek için tendonlardan nasıl örnek alınacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.