Hücre içi sinyal iletimi Upconversion nanopartikül aracılı kinaz Photoactivation tarafından uzaktan tetiklemek için entegre bir sistem

Bu deneyin amacı, yakın kızılötesi ışınlama kullanarak enzimin fotoaktivasyonunun fizibilitesini göstermektir. Kafeslenmiş protein kinaz A, hücrelere mikroenjeksiyonla aktarılan yukarı dönüştürücü nanopartiküllerin yüzeyine immobilize edilmiştir ve yakın kızılötesi ışınlama sonrası canlı hücrelerde kinazla tetiklenen yanıt gözlemlenmiştir. Geleneksel fotoaktivasyon, fototoksik UV ışığı gerektirir ve kaçınılmaz olarak istenmeyen kimyasal reaksiyonları ve benzer yanıtları eş zamanlı olarak tetikler; ancak, yakın kızılötesi ışınlama gibi dostça seçeneklerimiz, düşük enerjisi nedeniyle reaksiyonu tetiklemez.

Yukarı dönüştürücü nanoparçacık, doğrudan UV ışınlaması olmaksızın parçacık yüzeyine yakın bir kimyasal reaksiyonu tetiklemek için, biyouyumlu düşük enerjili yakın IR fotonlarını yüksek enerjili UV fotonlarına etkili bir şekilde dönüştürebilir. Kinazlar onkogenezde kilit bir rol oynar; bu teknik, UV fototoksisitesinden ve yan reaksiyonlarından kaynaklanan girişimci gürültüyü çok daha düşük tutarak daha fazla sinyal iletim bilgisini incelememize yardımcı olabilir. Genel olarak, bu alana yeni giren kişiler, yukarı dönüştürme uygulaması için cihazların ve optik düzeneğin modifiye edilmesinde zorluklarla karşılaşacaktır.

Başlamak için, lazerin küvetin ortasına odaklanabilmesi için florospektrometrenin küvet tutucusunun yanına 4x objektif lensi yerleştirin. Ayarlanabilir bir 980 nanometre lazer diyotu, objektif lense 90 derece açıyla yerleştirin. Objektif lens ile lazerin ışık yolu kesişimine tam yansıtıcı bir ayna kurun.

İç aksamı korumak için spektrometrenin eksitasyon penceresini kapatacak anodize metal bir plakayı yerleştirmeyi unutmayın. Ardından, tutucuya silika kaplı yukarı dönüşümlü (upconversion) nanoparçacık çözeltisi içeren bir küvet yerleştirin. Lazer açıldığında parlak bir yukarı dönüşümlü ışın görülebilir.

Hizalamalar sırasında en düşük PMT voltajı ile spektroskopi cihazını lüminesans moduna getirin. PMT'nin en güçlü sinyali alabilmesi için ışının küvetin ortasından geçmesini sağlayacak şekilde ayna ve lazer kademelerini ayarlayın. Dikroik bir ayna ve uyarım filtresi taktıktan sonra, alt katman ışık yoluna 980 nanometre bir lazer diyot yerleştirin.

Odak düzlemindeki NIR ışınlama alanının yayılmasına ve genişlemesine yardımcı olmak için lazer ile ayna arasına bir kolimatör ekleyin. Ardından, yakın kızılötesi ışını görselleştirmek için bir yükseltme (upconversion) nanopartikül çözeltisi kullanın. Hizalamayı tamamlamak için yakın kızılötesi ışık ışınını merkezlemek amacıyla lazer tablasının konumunu ayarlayın.

Metin protokolünde açıklandığı gibi caged-PKA sentezini gerçekleştirin ve caged-PKA/UCNP'yi demobilize ederek caged-PKA/UCNP oluşturun. UV fotolizinden önce her iki konstrüktün aktivitesini ölçmek için, analiz karışımına iki µL PKA çözeltisi eklendikten sonra analiz karışımındaki NADH absorbansındaki azalmayı zamanla ölçün. Ölçümü PKA/UCNP için tekrarlayın.

Ardından, PKA'nın aktive edilebildiğinden emin olmak için, buzlu su banyosunda, caged-PKA ve caged-PKA/UCNP örneklerine santimetrekare başına 200 milliwatt UV fotoliz uygulayın. PKA aktivitesi, bir piruvat kinaz laktat dehidrogenaz enzim eşleşmeli testi ile belirlenir. PKA çözeltisinin eklenmesinden sonra, NADH absorbansındaki azalma zamanla ölçülür.

İnkübatör dışında stabil pH kontrolü sağlamak amacıyla, mikroenjeksiyon süresince hücreleri %10 fetal bovine serum içeren L15 ortamında inkübe edin. İğne çekiciyi, daha sonra yapılacak uç açma işlemi için çapı yaklaşık 1.5 mikron olan konik şeklinde bir uç oluşturacak şekilde ayarlayın. Ucu açmak için, iğneyi mikroenjektöre yerleştirin, iğne ucunu bir lamın kenarına temas ettirin ve mikroskop tablasındaki hafif bir düğmeyi kullanarak işlemi gerçekleştirin.

Bu titreşim kuvveti, ucu hafifçe kırmak ve açıklığı genişletmek için yeterlidir. İğne açıklığının dış çapının 1,3 ile 1,5 mikron arasında olduğundan emin olmak için inceleme yapın; bu durum 40x objektif lens kullanılarak alınan mikroskop görüntüleri ile doğrulanabilir. Ardından, enjeksiyon basıncını 50 ile 75 hektopaskal arasında, basınçlı aralığı 200 ile 300 milisaniye olarak ayarlayın ve ortamın iğneye geri akmasını önlemek için sabit kompanzasyon basıncını 15 ile 30 hektopaskal olarak belirleyin.

Kafesli-PKA/UCNP kompleksini TAMRA boyası ile iğnenin arka konumuna yükleyin. Yüklenen iğne daha sonra, 30 ila 45 derecelik bir açıyla tek eksenli hidrolik mikromanipülatör üzerine yerleştirilir. Örnek yüklemesinden sonra hava kabarcığı oluşmadığından emin olmak için iğneyi mikroskop altında kontrol edin.

İğneyi besiyerine daldırdıktan sonra, enjeksiyon basıncı uygulandığında boyanın hızla salındığını ve dengeleme basıncı sürekli uygulandığında boyanın yavaşça salındığını onaylamak için floresan moda geçin. Ardından, hücre mikroenjeksiyonuna başlamak için faz kontrastlı parlak alan moduna geçin. Başarılı enjeksiyonlarda membran şok dalgası gözlemlenebilir.

Hücreleri iki kez yıkayın ve başarıyla mikroenjekte edilen hücreleri tespit etmek için enjekte edilen hücrelerde beraber enjekte edilen TAMRA floresansını kontrol edin. UCNP girişi olan ancak beraber enjekte edilen boya sinyali olmayan hücreler, enjeksiyon sırasında hücre membranının yırtıldığını gösterir ve sonraki deneylerden hariç tutulmalıdır. Hücreleri, 10x objektif lens ile odaklanmış alt katman ışık yolundaki 980 nanometre lazer diyot ile 15 dakika boyunca ışınlayın.

Isınmayı önlemek için her beş dakikalık ışınlama sonrası beş dakikalık bir karanlık ara verin. Saniyeler hatta saniyenin altındaki süreler gibi daha kısa bir aktivasyon süresi gerekiyorsa, daha yüksek odaklanmış foton yoğunluğu için basitçe 40x objektif lensine geçiş yapın. Fotoliz ve hücre toparlanmasının ardından, hücreleri daha sonra yapılacak alexa 594 boyamasından önce, PBS içindeki bir mililitre veya %4 paraformaldehit ile 20 dakika boyunca fikse edin.

Son olarak, NIR ile indüklenen stres lifi disintegrasyonunu görselleştirin. NIR ışınlamasından sonra, beyaz oklarla belirtilen caged-PKA/UCNP mikroenjekte edilmiş hücreler, yukarı dönüştürme emisyonu gösterir. Başarılı bir PKA NIR fotoaktivasyonunun neden olduğu stres lifi disintegrasyonu, daha fazla f actin açığa çıkarır ve sonuç olarak UCNP yakınında güçlü yeşil boyama ile sonuçlanır.

Hücrelerin mikroenjeksiyon işlemine tabi tutulduğu ancak karanlıkta bırakıldığı negatif kontrolde, stres liflerinde herhangi bir parçalanma görülmez. NIR fotoaktivasyonu sonrası f aktin maruziyet seviyesi, alexa 594 ile boyanabilir ve ardından image J ile nicelleştirilebilir. Kırmızı ok boyunca f aktin boyanmasının yoğunluk eğrileri çizilmiş olup, bu eğriler NIR kaynaklı PKA aktivitesi ile ilişkilendirilebilen stres lifi parçalanmasına dair nicel bilgiler sağlamıştır. Mikroenjeksiyona alışıldıktan sonra bu teknik, hazırlık ve caged-PKA/UCNP kalite kontrolü dahil olmak üzere bir gün içinde tamamlanabilir.

Enstrüman modifikasyonlarımız ve deneylerimiz için sunduğumuz talimatlarla, istenen reaksiyon; geleneksel titrasyon yöntemlerinde kullanılan UV ışığı gibi yüksek uzaysal-zamansal çözünürlükte, ancak fototoksisite riski olmadan ve bulaşıcı olmadığı için yakın IR ile tetiklenebilir. Bu videoyu izledikten sonra, hücre uyumlu yakın IR ışığı kullanarak enzim nanoparçacık kompleksinin mikroenjeksiyon yoluyla bir hücreye nasıl iletileceği ve enzimin nasıl fotoaktive edileceği konusunda iyi bir anlayış kazandığınızı umuyoruz. Bu teknik, hücrenin UV fototoksisitesini tolere edemediği durumlarda, canlı hücrelerde uzaysal-zamansal çözünürlük için istenen enzimatik reaksiyonu tetiklemek amacıyla ışık kullanması gereken kimyasal biyoloji alanındaki araştırmacıların önünü açmıştır.

Bu prosedürü takiben, spasyo-temporal fotoaktivasyon gerektiren ek soruları yanıtlamak için yükseltme nanopartikülüne diğer biyolojik etkileyiciler ilişkilendirilebilir. Eğer biyolojik etkileyici hücre dışı çalışıyorsa, mikroenjeksiyona bile gerek yoktur. Yakın IR fotoaktivasyon platformu, dokularda daha fazla penetrasyon derinliği sağlayabilir ve bu nedenle, istenen reaksiyonları belirli bir zamanda ve konumda tetiklemek için küçük hayvanlarda uygulanabilir.