Mikrosıvısal Bioprinting mühendisliği için doku ve Organoids skarların

Bu mikroakışkan biyo-baskı metodolojisinin genel amacı, vaskülarize bir doku yapısı oluşturmaktır. Bu yöntem, vaskülarize dokuların biyofabrikasyonunda anahtar soruları çözebilir. Bu tekniğin ana avantajı, ikincil bir hücre tohumlama işlemi yoluyla vaskülarize dokuların mühendisliği için üç boyutlu şekil kontrollü bir vasküler tekne oluşturmada çok yönlü olmasıdır.

Bu protokol vaskülarize kalp dokularının mühendisliği hakkında fikir verse de, karaciğer, cilt ve hatta kanserler gibi diğer birçok doku tipine de uygulanabilir. Bu yönteme yeni olan genel kişiler, biyoyazıcıyı kurmak basit olmayabileceği için mücadele edebilir. Bu prosedürü başlatmak için, kılıf görevi gören daha büyük künt iğnenin merkezine çekirdek görevi gören daha küçük bir künt iğne sokarak çift katmanlı eşmerkezli bir mikroakışkan baskı kafası oluşturun.

Çekirdek iğnenin dış kabuktan yaklaşık bir milimetre çıkıntı yaptığından emin olun. Bundan sonra, merkezi iğnenin namlusuna ters yönde 23 gauge bir iğne yerleştirin. Dış iğnenin namlusunun yan tarafında bir delik açın ve eşleşen boyutta bir metal konektör yerleştirin.

Epoksi yapıştırıcı ile kapatın. Ekstrüderi, bir polimetil metakrilat veya PMMA tutucu kullanarak bir biyoyazıcının kafasına monte edin. Biyomürekkebin ve çapraz bağlama çözeltisinin iki PVC tüpten ayrı ayrı enjeksiyonu için, baskı kafasının girişlerini çift kanallı bir şırınga pompasına bağlayın.

Biyomürekkebi aljinat, gelMA ve foto başlatıcı karışımı kullanarak yapın. % 10 fetal sığır serumu veya FBS içeren 25 milimolar HEPES tamponunda çözülür. Daha sonra, çapraz bağlama taşıyıcı sıvısı olarak hizmet etmek üzere% 10 FBS içeren HEPES tamponunda 0.3 molar kalsiyum klorür çözeltisi yapın.

Biyobaskıdan hemen önce, insan göbek damarı endotel hücrelerini veya HUVEC'leri beş ila 10 dakika boyunca deneyin. Hücreleri 15 mililitrelik bir tüpte beş dakika boyunca 800 RPM'de santrifüjleyin. Biyomürekkepteki hücreleri, beş ila 10 kez yavaşça pipetleyerek mililitrede beş ila 10 kez, 10 ila altı hücre konsantrasyonunda yeniden süspanse edin.

Daha sonra, HUVEC'in laiden bioink'inin enjeksiyonunu başlatmak için çift kanallı bir şırınga pompası kullanın ve diğer kanaldan dakikada beş mikrolitrelik bir akış hızında çapraz bağlama sıvısı. Akışların stabilize olana kadar bir dakikaya kadar sürekli çalışmasına izin verin. Bundan sonra, biyoyazıcı biriktirme hızını saniyede yaklaşık dört milimetre koruyarak baskı kafası hareketini başlatın.

Bu biyo-baskı, aljinat bileşeninin hızlı iyonik jelleşmesine ve bir mikrofiber iskelenin birikmesine neden olmalıdır. İskele basıldıktan sonra, kimyasal jelleşmeyi gerçekleştirmek için jelMA bileşenini 20 ila 30 saniye boyunca santimetre kare başına beş ila 10 miliwatt UV ışığı ile çapraz bağlayın. Ardından, 37 santigrat derece ılık PBS ile nazikçe durulayarak fazla kalsiyum klorürü iskeleden çıkarın.

Bu iskeleyi endotel hücre büyüme ortamında 37 santigrat derecede yüzde beş hacim CO2'de 16 güne kadar kültürleyin. Ortamı en az iki günde bir değiştirin. Kültür periyodu boyunca, HUVEC'leri, iskele mikrofiberlerinin çevresine göç edene ve lümen benzeri yapılar oluşturana kadar mikroskop altında izleyin.

Ardından, bir parça steril filtre kağıdı kullanarak tüm ortamı iskelenin intrastisyel boşluğundan kılcal kuvvetle dikkatlice çıkarın. İskelenin üstüne kardiyomiyositler gibi ikincil bir hücre tipinden bir damla süspansiyon ekleyin ve hücrelerin tüm intrastisyel boşluğa sızmasına izin verin. Bundan sonra, bu iskeleyi bir inkübatörde 30 dakika ila iki saat boyunca inkübe edin ve hücrelerin tek tek mikrofiberlere yapışmasına izin verin.

İskeleyi PBS ile nazikçe yıkayarak yapışmayan hücreleri çıkarın. İstenilen vaskülarize doku oluşana kadar bu iskeleyi uygun ortamda kültürleyin. Burada açıklanan mikroakışkan biyo-baskı, düşük viskoziteli biyomürekkepler kullanılarak mikrolifli iskelelerin doğrudan biyo-baskısına izin verir.

Altı x altı x altı milimetre kare boyutunda < 30'dan fazla mikrofiber içeren bir iskele, 10 dakika içinde biyolojik olarak basılabilir. İskele mikrograflarının üstten ve yandan görünümleri, biyo-baskı işlemi sırasında mükemmel yapısal bütünlüğü gösterir. Aljinat bileşeninin kalsiyum klorür ile anında iyonik çapraz bağlanması ile elde edilir.

Biyomürekkebin mikroakışkan ekstrüzyonu, iyonik çapraz bağlama ve foto çapraz bağlamadan sonra, HUVEC'ler nispeten yüksek bir canlılığı korudu. Hücreler çoğaldı ve sıfırıncı günde başlangıçta rastgele dağılımdan, 16. günde mikrofiberlerin çevrelerine göç etti. İskele üzerine ekilen yenidoğan sıçan kardiyomiyositleri olgunlaştı ve iskeleyi doldurdu.

Fonksiyonel kardiyak biyobelirteçlerin güçlü ifadesini gösterdiler. Sarkomerik alfa aktinin ve connexin 43 gibi. Kardiyomiyositlerle doldurulmuş biyobaskılı bir mikrofibröz iskelenin konfokal mikroskobu, hem HUVEC'lerin hem de kardiyomiyositlerin bir arada bulunduğunu ortaya çıkardı.

HUVEC'ler esas olarak mirkofiberlerin sınırlarında bulunurken, kardiyomiyositler mikrofiberlerin dışını çevreler. Hücreler, spontan ve senkronize atışlarını dokuz ila 28 güne kadar sürdürebildiler. Hücre kaynağına ve iskelelerin konfigürasyonuna bağlı olarak.

Bu videoyu izledikten sonra, mikroakışkan biyobaskı tekniğinin yanı sıra baskı kafası imalatı ve biyoyazıcı işlemleri kullanılarak vaskülarize dokuların nasıl üretileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi çok önemlidir, çünkü baskı kafasının üretimi ve biyoyazıcının işlemleri daha önce kullanmamış kişiler için zor olabilir. Bu prosedürü denerken, biyo-baskıya başlamadan önce iki iğneyi yazıcı kafasında eş merkezli hale getirmeyi ve akışın stabilize olmasını sağlamayı unutmamak önemlidir.

Bu tekniğin gelişmesiyle birlikte, doku mühendisliği ve biyofabrikasyon alanındaki araştırmacılar artık in vivo rejenerasyon amacıyla veya in vitro dokuları modellemek için vaskülarize doku yapıları oluşturmak için başka bir olanak sağlayan araca sahipler.