Hızlı, yönlendirilmiş farklılaşma insan embriyonik veya İndüklenmiş Pluripotent kök hücrelerinden retina Pigment epitel hücrelerinin

Bu yöntemin genel amacı, pluripotent kök hücrelerin retinal pigment epitel hücrelerine farklılaşmasını homojen bir tabaka halinde etkili bir şekilde yönlendirmektir. Bu yöntem; retinanın nasıl geliştiği ve bir kök hücre hastalık modelinin nasıl kurulacağı gibi retina ve göz araştırmaları alanındaki soruların yanıtlanmasına yardımcı olur. Bu tekniğin temel avantajı, spontan yöntemlerden daha hızlı ve daha verimli olmasıdır.

Bu yöntem, kök hücrelerin 14 gün içinde immatür RPE'ye ve üç ay sonra olgun fonksiyonel RPE'ye farklılaşmasını yönlendirmek için büyüme faktörleri ve küçük moleküllerin bir kombinasyonunu kullanır. Prosedürün bölümlerini, UC Santa Barbara'daki kök hücre biyolojisi ve mühendisliği laboratuvarınınlele direktörü Cassidy Arnold uygulamalı olarak gösterecektir. Bu prosedüre başlamak için, pasajlama öncesinde kök hücre kolonilerini besleyici hücre içermeyen, serumsuz koşullarda yaklaşık %80 konfluense kadar büyütün.

Ardından, 12 kuyucuklu bir plakayı üretici önerilerine uygun olarak hücre dışı matris tabanlı hidrojel ile kaplayın ve oda sıcaklığında bir saat veya 4 °C'de gece boyunca setleşmeye bırakın. Bundan sonra, sıfırıncı gün için gerekli olan retinal diferansiyasyon medyumu ve kalsiyum veya magnezyum içermeyen PBS hacimlerini alikotlayın ve bunları bir su banyosunda 37 °C'ye ısıtın. Daha sonra, ısıtılmış RDM'ye büyüme faktörlerini ekleyin ve EDTA'yı oda sıcaklığına getirin.

Gerekirse, farklılaşma için pasajlanacak kök hücrelerden, morfolojiye dayanarak farklılaşmış tüm kolonileri P10 pipet ucuyla temizleyin. Koloniler arasındaki fibroblastik hücrelerin yanı sıra koloniler içindeki opak hücreler, temizlenmesi gereken farklılaşmış hücreleri gösterir. Hücrelerin manuel olarak temizlenmesi, protokolün en kritik adımlarından biridir; çünkü tamamen farklılaşmamış bir kök hücre popülasyonu ile başlamak, daha etkili bir zenginleştirme sağlar.

Kök hücrelerdeki medyumu aspire ederek ve kuyucukları bir kez 2 mL önceden ısıtılmış PBS ile yıkayarak, altı kuyucuklu bir plakanın tek bir kuyucuğunu 12 kuyucuklu bir plakanın dört kuyucuğuna aktarın. Ardından PBS'yi aspire edin ve her bir kuyucuğu kuyucuk başına 1 mL EDTA ile üç kez durulayın. Daha sonra plakayı nazikçe eğerek EDTA'yı aspire edin.

Hücrelerin vaktinden önce kalkmasını önlemek için plakayı hiçbir şekilde sarsmayın. Üçüncü yıkamadan sonra, tekrar bir mililitre EDTA ekleyin ve plakayı çeker ocak içerisinde oda sıcaklığında üç ila beş dakika inkübe edin. Bu inkübasyon sırasında plakayı rahatsız etmeyin.

Ardından, EDTA'yı aspire edin ve yerleştirilecek her kuyucuk için bir mililitre RDM artı 0,5 mililitre ekstra besiyeri ekleyin. Örneğin, 12 kuyucuklu bir plakanın dört kuyucuğuna ekim yapmak için altı kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğunu 4,5 mililitre RDM ile yıkayın. Daha sonra, hücreleri nazikçe ayırmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.

Hücreleri, kuyucuk içinde beş kez pipetle yukarı ve aşağı çekerek RDM içerisinde triture edin ve plakaya yeniden yapışmalarını önlemek için bu adımı hızlıca tamamlayın. Konik bir tüpe aktarın. Büyük hücre kümelerini ayırın ancak tek hücre süspansiyonu elde etmek için triture etmeyin.

Hücrelerin plakaya yeniden yapışmasını önlemek için hücreleri pipet içinde eşit olarak dağıtın ve bu adımı hızlıca tamamlayın. İstenirse, hücre kümelerinin boyutunu gözlemlemek için bir ışık mikroskobu kullanın. Ardından, hücreleri ECM kaplı, 12 kuyucuklu plakalara ekimleyin.

Hücrelerin kuyucuklara eşit şekilde dağılması için plakayı ileri geri eğleyin ve bir sonraki besiyeri değişimine kadar 37 °C ve %5 CO2 sıcaklığındaki bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Bu prosedürde, altı kuyucuklu bir plakayı üretici tavsiyelerine uygun olarak büyüme faktörü azaltılmış ECM ile kaplayın. Oda sıcaklığında bir saat veya dört °C'de gece boyunca sabitlenmesini bekleyin.

Ardından, her bir zenginleştirme kuyucuğu için gerekli miktarda DPBS ve bir mililitre RDM'yi alikotlayın ve bunları bir benmari içinde 37 °C'ye ısıtın. Trypsin benzeri enzimi oda sıcaklığına getirin ve gerekli miktardaki RPE destekleyici medyumu 37 °C'ye ısıtın. Bundan sonra, final konsantrasyonu 0.5x antimikrobiyal ve 10 µM ROCK inhibitörü olacak şekilde RSM'ye bir antimikrobiyal reaktif ve ROCK inhibitörü ekleyin.

Yapışmayı artırmak için ilk dört ila yedi gün boyunca bu ortamı kullanın. Ardından, tüm kuyucuklardaki kullanılmış ortamı aspire edin ve her kuyucuğa bir mililitre önceden ısıtılmış, büyüme faktörü içermeyen RDM ekleyin. Gerekirse, bir diseksiyon mikroskobu altında P10 pipet ucu kullanarak tüm non-RPE hücrelerini diseke edin ve kazıyarak temizleyin.

Diseksiyondan sonra, RDM'yi ve tüm hücre kalıntılarını aspire edin ve her kuyucuk için bir mililitre önceden ısıtılmış DPBS ile iki kez yıkayın. Ardından, 12 kuyucuklu bir plakanın her kuyucuğuna 0,5 mililitre TDE ekleyin ve 37 °C'de beş dakika boyunca inkübe edin. Sonrasında, hücreleri plakadan nazikçe uzaklaştırmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.

Homojen bir süspansiyon oluşturmak için hücre enzim süspansiyonunu pipetle üç ila dört kez yukarı aşağı çekerek nazikçe tritüre edin. Ardından, hücre enzim süspansiyonunu ROCK inhibitörü içermeyen önceden ısıtılmış RSM içinde 1'e 10 oranında seyreltin. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında beş dakika boyunca 173g hızında santrifüjleyin.

Beş dakika sonra, hücre peletinden medyumu aspire edin ve hücreleri 10 micromolar ROCK inhibitörü içeren RSM içinde yeniden süspande edin. Ardından, hücreleri 40 micrometer gözenekli bir naylon ağ hücre süzgeci kullanarak süzün. Bir hemositometre kullanarak hücre sayısını sayın ve süzülmüş çözeltideki hücre konsantrasyonunu hesaplayın.

Ardından, hücreleri büyüme faktörü azaltılmış, ECM kaplı plaklara, 10 µM ROCK inhibitörü içeren 4 mL RSM içerisinde, santimetrekare başına 1x10⁵ hücre olacak şekilde ekleyin. Hücre ekiminden 48 saat sonra RSM'yi 10 µM ROCK inhibitörlü olanla değiştirin ve medyayı her üç ila dört günde bir yenilemeye devam edin. Dört ila yedi gün sonra RSM'ye ROCK inhibitörü eklemeyi bırakın.

Hücrelerin 37 °C ve %5 CO2 ortamında 28 ila 35 gün boyunca olgunlaşmasını bekleyin ve RSM'yi her üç ila dört günde bir değiştirmeye devam edin. Burada, farklılaşma için pasajlanmadan hemen önceki indüklenmiş pluripotent kök hücreler gösterilmiştir. Kök hücreler küçüktür ve koloniler içinde yoğun bir şekilde paketlenmiştir; kolonilerin arasında fibroblastlar gibi farklılaşmış hücreler veya koloniler içinde opak geçişler görülmemektedir.

İkinci gündeki olgunlaşmamış RPE hücreleri burada görülmektedir. Bu aşamadaki hücreler hala subkonfluent olmalı ve hücreler arasındaki boşluklara doğru uzantılar çıkarmalıdır. Bu hücreler, 14. günde zenginleştirmeyi kaldırmak için yapılacak seçimden önceki aşamadadır.

RPE dışı hücreler yamalar veya opak şeritler şeklinde görünür. Yuvarlak yama fibroblastik morfolojiye sahip hücreler içerirken, opak yamaların nöral retina olduğu düşünülmektedir. Bu görüntüler, 30. gündeki pasaj sıfır, bir ve üç aşamalarındaki RPE'yi göstermektedir.

Her pasajda hücreler konfluent olmalı ve faz-parlak sınırları ile poligonal şekil dahil olmak üzere retinal pigment epitelyum morfolojisinin temel özelliklerini göstermelidir. Uzmanlaşıldığında, pasajlama ve zenginleştirme teknikleri, hücre kültürünün ölçeğine bağlı olarak bir ila iki saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürün ardından, RPE'nin büyüme faktörlerini salgılama veya dış segmentleri fagosite etme yeteneği hakkındaki soruları yanıtlamak için gen veya protein kantifikasyonu ve fonksiyonel analizler gibi teknikler kullanılabilir.

Dave Buchholz tarafından 2013'te ve Lindsay Leach tarafından 2015'te yayınlanan makaleler, bu yöntemin geliştirilmesini ve optimize edilmesini ayrıntılı olarak açıklamaktadır. Alanındaki araştırmacıların kolayca erişebilmesi için prosedürdeki her bir adımın ayrıntılı ve kapsamlı bir gösterimini sunduk. Deneylerinizde başarılar dileriz.