Yüksek işlem hacmi sterilizasyon Arabidopsis tohum için standart yöntem

Bu prosedürün genel amacı, mikrobiyal büyümeyi önlerken çok sayıda Arabidopsis genotipinin başarılı tohum sterilizasyonu için standartlaştırılmış koşullar sağlamaktır. Bu yöntem, bir seferde yüzlerce tohum örneğini sterilize etmenize olanak tanır, böylece genomik, proteomik, metabolomik ve diğer yüksek verimli çalışmalar alanlarında kritik bir bitki materyali hazırlama adımını basitleştirir. Bu tekniğin temel avantajı, çok sayıda tohum numunesi için verimli sterilizasyonun yüksek çimlenme oranı ile birleştirildiği koşulları sağlamasıdır.

Başlamak için, damıtılmış su ile% 50'lik bir ağartma çözeltisi hazırlayın. Her 200 mililitre çamaşır suyu çözeltisine 50 mikrolitre TWEEN 20 deterjan ekleyin. Çamaşır suyu solüsyonu, sadece steril koşullarda açıldığı sürece bir aya kadar saklanabilir.

Daha sonra, 100 tohumu 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne alın. Bu, manuel olarak veya özel yapım bir tohum robotu kullanılarak yapılabilir. Şimdi, laminer bir akış başlığında, tohumlara 500 mikrolitre% 50 ağartma çözeltisi ekleyin.

Daha sonra, tüpleri bir döndürücüye aktarın ve tohumları ağartıcıda 10 dakika boyunca hafif çalkalama ile inkübe edin. 10 dakika sonra, ağartıcı solüsyonu tüplerden mümkün olduğunca çıkarın. Ardından, 500 mikrolitre steril damıtılmış su ekleyin ve karıştırmak için tüpleri ters çevirin.

Tohumların çökelmesine izin verin, ardından suyu aspire edin ve tohumları tekrar yıkamak için başka bir alikot ile değiştirin. Sterilize edilmiş damıtılmış su ile toplam altı yıkama yapın. Tohumlar suyla iyice yıkandıktan sonra, kaplamadan önce bir mililitre suda bekletin.

Sterilizasyon işlemine başlamadan önce, klor gazı üretmek için gereken ağartıcı ve hidroklorik asit hacimlerini hesaplayın. Önerilen %6 klor gazını elde etmek için verilen denklemi kullanın. Başarılı bir sterilizasyon sağlamak ve sıçramayı önlemek için gereken HCl hacmini hassas bir şekilde hesapladığınızdan emin olun.

Bu protokol sırasında eldiven ve laboratuvar önlüğü giydiğinizden emin olun ve eldivenleri asit veya çamaşır suyu ile ıslandıklarında değiştirin. Bir davlumbaz altında, tohum şişelerini kapakları açık olarak bir rafa aktarın. Ardından, rafı sterilizasyonun gerçekleşebileceği plastik bir kaba yerleştirin ve kapağı kabın üzerine kapatmak için parafin film şeritleri hazırlayın.

Şimdi, beheri 100 mililitre çamaşır suyu ile doldurun ve ardından içine 250 mililitrelik bir beher yerleştirin. Fazla ağartıcı kullanmak bir güvenlik özelliğidir ve beher, içerdiği çözeltinin toplam hacminin en az iki katı olmalıdır. Ayrıca, ağartıcıyı ve asitleri her zaman ayrı ayrı kullanın.

Daha sonra, behere üç mililitre hidroklorik asit ekleyin ve ardından kabı hemen kapatın ve parafilm ile kapatın. Sterilizasyon sırasında gazın biriktiğinden emin olmak için kabı bir saat izleyin. Klor gazı ya kabın içinde soluk sarı bir pus olarak görünmelidir ya da çözeltinin sararıp sararmadığı kontrol edilebilir.

Kabın üzerindeki contayı periyodik olarak kontrol edin. Kapak yerinden çıkarsa veya parafin contası gevşemeye başlarsa, kapağı ek bir parafin film tabakasıyla sıkıca yeniden kapatın. Bir saatlik sterilizasyondan sonra, gazı üç saatlik bir süre boyunca boşaltmak için kabın bir köşesini açın.

Üç saatlik havalandırmadan sonra, tüm tüpleri kapatın ve sterilize edilmiş tohumları kaplanana kadar kuru koşullarda saklayın. Şimdi, katıları çözmek için bir cam çubukla karıştırırken yavaşça 1.5 gram sodyum bikarbonat tozu ekleyerek reaksiyonu nötralize edin. Karbondioksit gazı kabarcıkları oluşmayı bırakana kadar sodyum bikarbonat eklemeye devam edin.

Ardından, çözeltinin pH'ını ölçün ve gerekirse, pH nötr olana kadar ilave sodyum bikarbonat ekleyin. Çözeltinin kokmaması koşuluyla atılabilir. Aksi takdirde, tüm kokular dağılana kadar bekleyin.

Gazla sterilize edilmiş tohumların her bir tüpüne 500 mikrolitre sterilize edilmiş damıtılmış su ekleyin. Ardından, tohumları bir MS tabağına dökün ve steril tek kullanımlık bir aşılama halkası veya steril bir pipet ucu kullanarak eşit şekilde yayın. Dört santigrat derecede üç günlük tohum tabakalaşmasından sonra, plakaları 16 saat günlük ışığa maruz bırakarak 23 santigrat dereceye aktarın.

Köklerin ortama doğru büyümesi için kapakları üstte tutun. Sekiz günlük büyümeden sonra, çimlenen tohumların oranını puanlayın. Çimlenme, radikal tohum kabuğunun dışına çıkıntı yaptığında ve iki kotiledon görünür olduğunda sayılır.

Ayrıca, sterilizasyon koşullarının etkinliğini belirlemek için küften etkilenen tohum sayısını sayın. Columbia yabani tip tohumlar üzerinde beş farklı maruz kalma süresinde dört farklı ağartıcı konsantrasyonu test edildi. Yüksek ağartıcı konsantrasyonları, çok fazla maruz kalma ile çimlenmeyi olumsuz etkiledi.

Bununla birlikte, tüm maruziyet sürelerinde %40 ve %50 çamaşır suyu ile yüksek çimlenme oranları gözlenmiştir. Yüksek ağartıcı konsantrasyonları ile sterilize edilen tohumlar yüksek ölüm oranına sahipti ve genellikle büyüme kusurları gösterdi, ancak genellikle tamamen küfsüzdü. 10 dakika boyunca% 50 çamaşır suyu ile sterilizasyonun, küf önleme ve sağlıklı çimlenme arasında optimum dengeye sahip olduğu belirlendi.

Klor gazı sterilizasyon koşullarını optimize etmek için, Columbia yabani tip tohumlarını iki farklı süre boyunca sterilize etmek için üç farklı konsantrasyonda klor gazı kullanıldı. Zaman ve gaz konsantrasyonu arasında önemli bir etkileşim vardı. Bir saatte, çimlenme üzerinde hiçbir etki yoktu, oysa en yüksek gaz konsantrasyonu üç saatte zararlıydı.

Böylece bir saatlik bir sterilizasyon periyodu seçilmiştir. Küf oluşumu, üç saatlik gaz maruziyetleri veya altı veya% 17 gaz kullanan bir saatlik maruziyetler için etkili bir şekilde engellendi. Bu nedenle, bir saat boyunca% 6'lık bir gaz konsantrasyonunun çimlenme ve küf inhibisyonu için optimal olduğu belirlendi.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde gerçekleştirilirse günde yüzlerce tohum hattını başarılı bir şekilde sterilize etmek için kullanılabilir. Gazla sterilize edilmiş tohumlar ayrıca kuru koşullarda uzun süre saklanabilir. Bu prosedürü denerken, gerekli HCl ve ağartıcı hacimlerini hesaplamak için sağlanan denklemleri kullanmayı unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, çeşitli farklı genotipleri ve ilgilenilen fenotipleri birbirine bağlamak için genom çapında ilişkilendirme çalışmaları gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Deneylerinizde iyi şanslar.