Transkript bireysel Escherichia coli hücrelerdeki tek molekül Floresans In Situ hibridizasyon deneyleri için etiketleme yöntemi

Bu protokolün genel amacı, tek moleküllü FiSH deneylerinde görselleştirme için floresan etiketli DNA probları için E.Coli'deki bireysel transkriptleri etiketlemektir. Bu yöntem, sistem biyolojisi alanındaki, transkriptlerin karakterizasyonu, örneğin ilgilenilen alanın hücreden hücreye yeteneği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Hücre duvarı lokalizasyonunun transkriptlerinin yanı sıra.

Bu tekniğin temel avantajı, transkripsiyonel süreçlerin istatistikleri hakkında miktarda bilgi sağlamasıdır. Protokole başlamak için, E.Coli MG1655'i gece boyunca bir orbital çalkalayıcıda 260 RPM ve 37 santigrat derecede LB ortamında büyütün. Ertesi gün, gece boyunca kültürü taze ortamda bir ila 100 arasında seyreltin ve optik yoğunluğunu bir spektrofotometrede 0,2 ila 0,4 değerine kadar ölçün.

Daha sonra, hücreleri dört santigrat derecede 4.500 G'de beş dakika santrifüjleyerek peletleyin. Süpernatanı tüm tüplerden çıkarın. Her tüpe bir mililitre 1XPBS ekleyin ve hücreden hücreye agregasyonu en aza indirmek için peleti yeniden askıya alın.

Sonra dört mililitre fiksasyon tamponu ekleyin ve tüpü hafifçe girdaplayın. Numuneleri bir orbital çalkalayıcıda inkübe edin. Hücre görüntülemeyi engelleyebilecek hücreden hücreye agregasyonu en aza indirmek için peleti yeniden askıya alın.

İnkübasyondan sonra, hücreleri peletleyin, süpernatanı çıkarın ve bir mililitre 1XPBS ekleyin. Süspansiyonları 1.8 mililitrelik konik tabanlı mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Hücreleri santrifüjleme ile peletleyin.

Süpernatanı dikkatlice çıkararak bakteri geçirgenliğine başlayın. Pelet dışındaki tüm sıvıyı çıkarmak için küçük hacimli pipetler kullanın. Ardından, peleti 300 mikrolitre DEPC ile arıtılmış suda yeniden süspanse edin.

350 mikrolitre yüksek dereceli mutlak etanol ekleyin ve tüpü ters çevirerek çözeltiyi hafifçe karıştırın. 350 mikrolitre daha etanol ekleyin ve tekrar karıştırın. Daha sonra numuneyi tüp döndürücü ile oda sıcaklığında bir saat boyunca 20 RPM'de döndürün.

Hücreleri geçirgenlikten pellet haline getirin. Santrifüjlemeden sonra süpernatanı çıkarın. Numunelere bir mililitre %20 yıkama tamponu ekleyin.

Onları birkaç dakika bekletin. Daha sonra, 750 G ve dört santigrat derecede yedi dakika santrifüjleme ile pelet hücreleri. Süpernatanı çok nazikçe çıkarın ve peletin dışındaki tüm sıvıyı çıkarmak için küçük hacimli pipetler kullanın.

Daha sonra, oligonükleotid prob seti stok çözeltisini, nihai oligonükleotid konsantrasyonu 250 nanomolar olacak şekilde hibridizasyon tamponu alikotuna ekleyin ve tüpü kuvvetlice girdaplayın. Numuneleri, kabarcık oluşumunu önlerken, oligonükleotid problarını içeren 50 mikrolitre hibridizasyon tamponunda askıya alın. Numuneleri gece boyunca karanlıkta, 30 santigrat derecelik bir ısı bloğunda bırakın.

Yıkamayı hazırlamak için, görüntülenecek her numune için yeni bir mikro santrifüj tüpü edinin. Her tüpe bir mililitre yıkama tamponu ekleyin. Hibritleştirilmiş numunelerden yıkama tamponunu içeren yeni tüpe 10 ila 15 mikrolitre ekleyin.

Hücreleri santrifüjleme ile peletleyin. Ardından, süpernatanı çıkarın. Numuneleri iki kez daha yıkayın.

Peleti 25 mikrolitrelik yıkama tamponunda tekrar askıya alın. 10 mililitre 2X SSC tamponuna 150 miligram agaroz ekleyerek bir agaroz jeli hazırlayın. Agaroz tamamen eriyene kadar çözeltiyi her seferinde 10 ila 15 saniye mikrodalgada pişirin.

Ardından tüpü birkaç dakika soğuması için bir kenara koyun. Ardından, slaytın merkezi açıkta kalacak şekilde slaytın üzerine ayırıcı bir silikon çerçeve yerleştirin. Sürgünün ortasına 10 milimetre genişliğinde, bir ila iki milimetre kalınlığında sert bir halka yerleştirin.

Sızdırmazlık için merkeze az miktarda jel bırakın ve jelin sertleşmesi için birkaç dakika bekleyin. Daha sonra yüksek bir kubbe şekli oluşana kadar daha fazla jel ekleyin. Jelin sertleşmesi için yaklaşık 10 dakika bekleyin ve halkayı çıkarın.

Jelin üzerine 10 mikrolitre yıkama bakteri hücresi koyun ve sıfır numaralı kapak kayma sürgüsü ile kapatın. Foto ağartmayı önlemek için numuneyi karanlıkta tutun. E.coli hücrelerinin smFiSH ölçümleri, değişken hücre dışı D-fukoz konsantrasyonlarına yanıt olarak galK indüksiyon seviyesini gösterir.

Arka plan sinyali, galK silinmiş bir gerinim veya negatif kontrol olarak delta galK JW0740 ile gösterilir. Çoğu hücrede çok sayıda leke görülür. Bakteri kültürüne iki milimolar D-fukoz eklendiğinde tek veya birkaç galK transkriptine karşılık gelir.

Oysa hücre dışı D-fukoz yokluğunda birkaç nokta görülür. Bu protokolün uygulanması için başka bir örnek, vahşi tipte veya JW1648 sodB silinmiş bir suşta smFiSH'nin floresan ve faz kontrast görüntüleri ile sodB geni tarafından sağlanır. Bu protokolle hazırlanan örnekler, hücredeki transkriptlerin doğru bir şekilde hassaslaştırılmasını sağlayan STORM kullanılarak da görüntülenebilir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, sistem biyolojisi alanındaki araştırmacıların tek tek hücrelerdeki transkripsiyon olaylarının istatistiklerini keşfetmelerinin yolunu açtı.