Bleomycin ile fareler Airways önceden Merkezi Klima Orthotopic akciğer kanseri hücre Engraftment verimliliğini artırır

Bu prosedürün genel amacı, tümörü başlatan akciğer kanseri hücrelerinin farelerin hava yollarına nakledilmesinin etkinliğini arttırmaktır. Bu yöntem, ilaç direncinin nedenleri ve fibroz ile akciğer kanseri arasındaki ilişki de dahil olmak üzere kanser biyolojisindeki temel soruları yanıtlamak için yeni klinik öncesi modellerin oluşturulmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tümör başlatan hücrelerin çeşitli fare suşlarının akciğerlerine transplantasyon verimliliğini arttırmasıdır.

Bu tekniğin etkileri tedaviye doğru uzanır, çünkü tedaviye farklı klinik yanıtlara sahip olduğu bilinen daha çeşitli insan akciğer kanseri alt tiplerini modellememizi sağlar. Bu protokol için önce farelere bleomisin enjekte edilmelidir. Daha sonra 14 gün sonra tümör hücreleri enjekte edilir.

Her iki enjeksiyon için prosedür çok benzerdir ve burada açıklanmıştır. Enjeksiyondan iki saat önce, bleomisin stoğunu buz üzerinde çözün ve çalışma konsantrasyonuna kadar seyreltin. Buz üzerinde tutun.

Bir hücre bolusu için, metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlanmış bir hücre süspansiyonuna sahip olun. Her fare için işlem süresi hep birlikte yaklaşık 10 dakikadır. Bir ayak parmağı çimdikleme kullanarak uygun anesteziyi onayladığınızdan emin olun ve gözlere veteriner merhemi sürün.

Şu anda, farenin koyu renkli saçları varsa, doğru bir şekilde görüntülenebilmesi için tüm kaburga bölgesini hem ventral hem de dorsal olarak tıraş edin. Ardından, fareyi sırtı platforma gelecek şekilde ön dişlerinden sabitleyerek entübasyon platformuna yerleştirin. Bir hücre bolusu enjekte edilecekse, şimdi hafif bir tritürasyon ile yeniden süspanse edin.

Şimdi göğsün üst bölgesini aydınlatın, ağzı açın ve düz forseps kullanarak dili nazikçe dışarı çekin. İğneyi çıkararak trakea için bir IV kateter hazırlayın, ardından trakeal açıklığın üzerine yerleştirin. Daha sonra, kateterin üst kısmı ön dişlere yakın olana kadar kateteri trakeaya yerleştirin ve yerleşimini doğrulamak için kateterin içini aydınlatın.

Ardından, 50 mikrolitre taze yapılmış bleomisin veya hücre süspansiyonunu doğrudan katetere dağıtın. Tüm hacmin kateterden aşağı inmesi için birkaç saniye bekleyin. Ardından kateteri çıkarın ve %10'luk çamaşır suyuna atın.

Fare sıvıyı solumuyorsa, solunumunu dikkatlice izleyin ve kateter konumunu ayarlayın. Fare nefes almayı durdurursa, kateteri hemen çıkarın ve kateteri yeniden takmadan önce farenin nefes almasına izin verin. Kateteri çıkardıktan sonra, tedavi edilmiş, hala anestezi altında ve görüntüye hazır beş fareye sahip olmak için prosedürü gerçekleştirmeye devam edin.

Kurtarma için, fareyi bir kurtarma kafesinde IACUC onaylı bir ısıtma yastığına sırtüstü yatırın ve tamamen iyileşene kadar izleyin. Hücreleri enjekte ettikten iki veya üç dakika sonra, bir insülin iğnesi kullanarak retro-orbital olarak 100 mikrolitre lusiferin enjekte edin. Her görüntüleme seansında enjeksiyon için kullanılan gözü değiştirin.

En az iki dakika bekledikten sonra, bir hayvan biyolüminesans görüntüleyicisine en fazla beş fareyi sternal yaslanma pozisyonunda yerleştirin ve lüminesans ayarlarını kullanarak bir sırt resmi elde edin. Kontrol panelinin altında, hücrelerin lüminesansını ölçmek için çözünürlük ve hassasiyet ayarlarını yapın. Çoğu uygulama için üç dakika ile başlayın, gruplamayı orta olarak ayarlayın, f/stop'u bir olarak ayarlayın, görüş alanını d olarak ayarlayın ve konu yüksekliğini 1,5 olarak ayarlayın.

Enjeksiyon başarılı olduysa, bir akciğerde veya her iki akciğerde üst göğüs bölgesinde bir sinyal tespit edilir. Hücreler trakeanın girişinde kümelenmişse, enjeksiyon başarısız olmuştur. Dorsal görüntüyü aldıktan sonra, fareleri çevirin ve ventral bir görüntü elde edin ve ayarı gerektiği gibi ayarlayın.

Görüntülemeden sonra, metin protokolünde açıklandığı gibi ameliyat sonrası bakıma devam edin. Ardından, bu görüntüleme protokolünü aşılamadan üç gün sonra ve daha sonra haftada bir tekrarlayın. Görüntüleri analiz etmek için bir biyolüminesans analiz yazılımı kullanın.

İlk olarak, serideki tüm uygun görüntüleri yükleyin. Bu bölüm bir yazılım paketiyle ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Daha sonra, her fare için, serinin ilk görüntüsünde, kare bir ilgi alanı oluşturun ve tüm akciğer bölgesini kaplayan üst göğüs bölgesinin üzerine yerleştirin.

Ardından, sağ tıklamayı kullanarak tüm ilgi alanlarını kopyala işlevine erişin ve gruptaki her görüntüye aynı ilgi alanlarını uygulamak için bu aracı kullanın. Ardından, her görüntüde, her farenin üst göğsünü kaplayacak şekilde karelerin konumlarını değiştirin. Bunu hem ventral hem de dorsal görünümler için yapın.

Şimdi, görüntü penceresinin sol üst köşesinde fotonlar işlevini seçin. Ardından hesaplama seçeneğini belirleyin. İlgilenilen bölgelerden gelen veriler daha sonra toplam akı olarak bir çıktı tablosunda görüntülenir.

Bu verileri gerektiği gibi analiz edin. Bağışıklık zayıfladığında, timik fareler bleomisin ile tedavi edildi. Hücre bolus aşılamasından önce, bleomisin ile tedavi edilen farelerde 14. günde geçici fibroz gözlendi, ancak araçla tedavi edilen farelerde gözlenmedi.

Daha sonra, yerleşik insan akciğer kanseri hücre hattı olan H2030'dan hücreler, bu farelerin akciğerlerine intratrakeal olarak verildi. 35 gün sonra, bleomisin ile tedavi edilen farelerde akciğer tümörü yükü yüksekti. Bununla birlikte, araçla tedavi edilen hayvanlarda herhangi bir tümör tespit edilmedi.

Akciğer tümörü yükü histoloji kullanılarak doğrulandı. Araç ile ön tedavi edilen akciğerlerde tümör nodülü bulgusu saptanmazken, bleomisin ön tedavi görmüş akciğerlerde büyük tümör nodülleri vardı. Metastatik bir H2030 BrM 3 hücre hattının nakledilmesinden 39 ila 57 gün sonra, biyolüminesans görüntüleme için çok yoğundu, bu nedenle uzak organlarda metastaz ex vivo olarak analiz edildi.

Çeşitli dokularda küçük lezyonlar tespit edilebilir, bu da bu yöntemin spontan olarak yayılan hastalığı incelemek için umut vaat ettiğini düşündürmektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, görüntüleme olmadan beş farenin kafesi başına 10 dakika ve fareleri görüntülerken de kafes başına 20 dakika içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, kateterin uygun şekilde yerleştirilmesini sağlamayı ve hayvanın solunumunu izlemeyi unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, aşılanmış tümörlerin ilaçlara nasıl yanıt verdiği veya akciğerlere özgü tümör stromal etkileşimlerini karakterize etmek gibi ek soruları yanıtlamak için farmakolojik çalışmalar veya hasat edilen dokunun aminoasetik kimyası gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, fizyolojik olarak ilgili bir ortamda hastadan türetilen ksenogreftler de dahil olmak üzere farklı fare suşlarına ve tümör modellerine uygulanabilir. Bleomisin ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken biyolojik tehlike başlığında manipülasyon ve uygun şekilde imha etme gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.