Algılama ve miktar için Plasmodium falciparum içinde sulu kırmızı kan hücreleri tarafından toplam yansıma kızılötesi spektroskopi zayıflatılmış ve çok değişkenli veri analizi

Bu işlemin genel amacı, çok değişkenli veri analizi ile ATR-FTIR spektroskopisi kullanarak sıtma paraziti tahmini için bir regresyon modeli oluşturmaktır. Bu yöntem, gelecekte hasta sonuçlarını iyileştirmeye yardımcı olabilecek bakım noktası tanılarının hızlandırılabına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, modelin oluşturulması biraz zaman alsa da, son derece taşınabilir, kullanıcı dostu, son derece hassas ve düşük maliyetli olmasıdır.

Bu yöntem sıtma parazitlerinin sayısallaştırılmasını mümkün kılmasına rağmen, antimikrobiyal ajanlara bağlı parazit bileşimindeki değişiklikler gibi çevresel değişikliklere yapılan fenotipik yanıtı gözlemlemek için de kullanılabilir. Bu fikir, Avustralya Senkrotron'da sıtma yalıtılmış hücreler üzerinde yaptığımız çalışmalardan gelişti. Bu tek hücreli seviyedeydi.

Oradan, atr-FTIR spektroskopisi aslında tanı testi geliştirmek için kullanmaya karar verdi. Senkronizasyon prosedürübaşlamadan önce, kültür 30 mililitre 3D7 zorlanma Plasmodium falciparum parazitler metin protokolünde açıklandığı gibi. Otomatik bir pipet kullanarak, kültürü yeniden askıya alın ve 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.

Kültürü standart laboratuvar koşullarında 300-400 kat g olarak beş dakika santrifüj edin. Peleti bozmadan otomatik bir pipetle çizerek süpernatantı çıkarın. Atık ortamı %10 çamaşır suyu çözeltisine atın.

Yavaş yavaş pelet için% 4 sorbitol çözeltisi 12 ila 15 mililitre ekleyin ve kültür homojen olana kadar tüp kapama ve ters çevirerek kültürü karıştırın. Kültürü 37 derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın. 15 dakika sonra, beş dakika için kültür santrifüj.

Peletrahatsız etmeden supernatant kaldırmak için otomatik bir pipet kullanın. Pelete %0,9 tuz 10 ila 15 mililitre ekleyin ve kültür homojen olana kadar tüpü kaplayıp ters çevirerek çözeltiyi karıştırın. Santrifüj ve tuzlu çözeltisi sorbitol tüm kalıntıları kaldırmak için iki kez daha yıkayın tekrarlayın.

Bu prosedürü başlatmak için, stok kırmızı kan hücreleri santrifüj, veya RBC. Supernatant çıkarın ve üç kez toplam% 0.9 tuzlu ile yıkayın. Stok RBC'leri ve kültürü 5 dakika boyunca 300 ila 400 kez g olarak santrifüj edin ve her tüpten süpernatant atın.

Sekiz mikrosantrifüj tüpünü belirtildiği gibi etiketle. Sonra her tüp için kültür uygun miktarda eklemek için 0,2 ila 20 mikrolitrelik pipet kullanın. Daha sonra, istenilen parazitseyreltme elde etmek için her tüp stok RBC uygun miktarda ekleyin.

Antikoagülan tüplerde toplanan taze donör kanı 1,200 kez g ve standart laboratuvar koşullarında 10 dakika santrifüj edin. Bir pipet ile çizerek ve% 10 çamaşır suyu çözeltisi içine atarak plazma çıkarın. Her mikrosantrifüj tüpüne 900 mikrolitre izole donör RBC ekleyin ve 10 kez ters çevirerek iyice karıştırın.

Basit bir tezgah üstü Zayıflatılmış Toplam Yansıma Fourier Transform Infrared veya ATR-FTIR spektrometresi spektrum elde etmek için kullanılacaktır. Kristali dairesel bir hareketle hafifçe temizlemek için ultra saf suyla nemlendirilmiş tüy bırakmayan mendiller kullanarak kristali hazırlayın ve temizleyin. Daha sonra, iyice kristal kurutmak için başka bir tiftik içermeyen silme kullanın.

Arka Plan Ölçümü'ne tıklayarak havanın arka plan ölçümlerini alın. Her 20 dakikada bir kristali temizleyin ve bu ölçümü tekrarlayın. Önizleme'yi tıklatarak canlı görünümü açın.

Kristalin temiz olduğunu gösteren düz, yatay bir taban çizgisini gözlemleyin. Pipet 10 mikrolitre deiyonize su doğrudan kristalin ortasına ve Ölçü Örneği'ni tıklatın. Tüy bırakmayan bir silme ve hafif dairesel bir hareket kullanarak kristali kurulayın.

Pipet 10 mikrolitre numune kristalin ortasına ve Ölçü Örneği'ni tıklatın. Kristali numuneler arasında temizleyin. Bu gösteride MATLAB kullanılarak çok değişkenli veri analizi yapılacaktır.

Veri işlemeye başlamak için, grafik kullanıcı arabirimini açmak için komut penceresine giriş çözümlemesi. Alma Verilerini bulmak için X kutusuna sağ tıklayın. Çözümleme için dosya türünü seçin.

Her kümedeki tüm spektrumları ayrı ayrı seçerek, Aç'ı tıklatarak ve her kümeye kısa bir ad vererek, örnek, su ve temel spektrumları işyerine veri kümesi olarak aktarın. Komut penceresinde Yeni Değişken'i tıklatın ve vektöre Parazitmia adını verin. Her numunenin Paraziti'ni girdirin.

Çizim Verilerini bulmak için X kutusuna sağ tıklayın. Verileri çizmek için Verileri Çiz simgesini tıklatın. Zum'u tıklatarak ve 1, 800-1, 400 santimetreyi yakınlaştırarak su buharı etkileri için spektrumları inceleyin, en açık şekilde Amide I ve Amide II bantlarının yamaçlarında kısa, keskin, dar zirveler olarak gözlendi.

Aşırı su buharı durumlarında, İşlem Öncesi Edit veri sekmesini açın ve Düzleme'yi seçin. Numuneyi ve su spektrumlarını yumuşatarak gürültüyü ve/veya güçlü su buharı katkılarını azaltın. Metin protokolünde açıklandığı gibi daha fazla veri işlemden sonra Verileri Edit sekmesini açın ve sütun değişkenlerinde yalnızca kutularının işaretli olduğundan emin olarak 2980-2800 santimetre ve 1750-850 santimetre seçin.

Veriler analiz için hazır. Ana bileşen çözümlemesi veya PCA gerçekleştirmek için Çözümlü Çözümayrış'ı tıklatın ve PCA'yı seçin. Model Oluştur'u tıklatın.

PC 1 ve PC 2 arasındaki skorlar arsa% 95 güven sınırı, kesik halka, gözlemleyin. Örnek spektrumları, sınırın dışında potansiyel aykırılayıcılar olarak gösteren puanlarla işaretlemek için Spectra'yı seç aracını kullanın. Kısmi en az kareregresyon veya PLSR gerçekleştirmek için Çözümleme Regresyonu'na tıklayın ve PLSR'yi seçin.

Sağ tıklayın Y bloğu ve vektör Paraziti yapı modeli seçin. Regresyon modelini ve regresyon vektörü analiz edin ve biyolojik bantları tanımlayın. RBC'lerin kısmi en az kareregresyon çizimi sıfır ile yüzde bir arasında yükselir Parasitemi0,87 R kare değeri ve %0,13 Parazitmi kök ortalama kare çapraz doğrulama hatası oluşturmıştır.

Bu, modelin x ekseninde bilinen Parazitmia ve y ekseninde öngörülen Parazitmiye ile her örnekte Parazitmi tahmin etme yeteneğini gösterir. İlişkili regresyon katsayısı, her bandın modelin tahmin yeteneğine katkısını açıklar. Grup ne kadar yoğunsa, modele o kadar çok katkıda bulunur ve böylece parazitin kanın kimyasal bileşimini nasıl değiştirdiği.

Sonuçlar, parazitlerden gelen sinyalin RBC'lerden yeterince farklı olduğunu ve gelecekteki veri kümelerinde parazitlerin tahmini için doğrusal bir regresyon modeli oluşturmak için kullanılabileceğini göstermektedir. Bir kez hakim, bu teknik düzgün yapılırsa örnek başına üç dakikadan az sürebilir. Bu prosedürü çalışırken, tüm kalıntı ATR kristalleri temizlemek için hatırlamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, P vivax ve P sıtma gibi diğer sıtma türleri gibi sorulara cevap vermek için modellenebilir, ATR-FTIR spektroskopisi türler arasında ayrım yapmak için yeterince duyarlı mı? Bu teknik, geliştirildikten sonra biyospektroskopi alanında araştırmacıların kanyoluyla bulaşan diğer patojenlerin tespiti ve niceliklerini keşfetmelerinin ve hatta kanda glikoz ve üre gibi analizlerinin yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, bir regresyon modeli oluşturmak için ATR-FTIR spektroskopisi ve NVDA analizi iyi bir anlayışa sahip olmalıdır.

Hasta kan ve sıtma örnekleri ile çalışan tehlikeli olabilir unutmayın, ve uygun biyogüvenlik düzeyi eğitim ve çevreleme her zaman bu prosedürü çalışırken yapılmalıdır.