Hepatit E virüs nano tanecikleri kimyasal konjugasyon yöntemlerle yüzey Functionalization

HEV nanopartiküllerinin yüzeyinin kimyasal olarak fonksiyonelleştirilmesinin genel amacı; tanı ve tedavi amacıyla, hedefleyici immünojenik, terapötik ve diyagnostik moleküllerin HEV nanopartiküllerinin yüzeyine konjugasyonu için tekrarlanabilir ve tutarlı bir yaklaşım sağlamaktır.

Bu yöntem, kanserin hedeflenmesinin artırılmasının ve nanoterapötiklerin dağılımının nasıl izlenebileceği gibi nanotıp alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı; genetik mühendisliğine kıyasla yüksek düzeyde tekrarlanabilir, verimli ve uygulanmasının çok daha kolay olmasıdır.

Prosedürleri, laboratuvarımızdan araştırma asistanları Michelle Nguyen ve Ivan Ruiz uygulamalı olarak gösterecekler.

Bu protokole, metin protokolünde açıklandığı şekilde hepatit E virüsü nanoparçacık üretimi ve saflaştırılması ile başlayın.

TEM görüntüleme için HEV nanoparçacık örneklerini 10 millimolar MES, pH 6.2 ile mililitre başına 0.5 ile iki miligram arasına seyreltin. Hidrofilik bir karbon yüzey oluşturmak için karbon kaplı gridleri 40 milliamp glow discharge ile 30 saniye boyunca iyonize edin. Gridlerin hidrofilik karbon yüzeyi, glow discharge işleminden sonra sadece 30 dakika boyunca etkin kalabilir. İyonizasyonun ardından, gridi ve pensi tutarak gride iki mikrolitre HEV nanoparçacık örneği ekleyin.

15 ila 30 saniye sonra, ızgarayı filtre kağıdı ile kurulayın. Ardından ızgarayı derhal çift distile su ile yıkayın ve tekrar filtre kağıdı ile kurulayın. Izgaraya hemen iki mikrolitre yüzde iki uranil asetat ekleyin. 15 saniye sonra, ızgarayı filtre kağıdı ile kurulayın. Numune ızgaralarını, gece boyunca elektronik bir nem alıcı kurutma kabinine yerleştirerek kurutun.

Numuneye bağlı olarak, yapı görselleştirme ve karakterizasyonu için kriyojenik elektron mikroskobu veya cryo-EM gerekli olabilir. Izgarayı bir TEM'e aktarın ve 10 ile 80K büyütmede görüntüleyin. HEV nanopartikülleri, viral RNA'nın yokluğu nedeniyle TEM'de çapları yaklaşık 27 nanometre olan boş ikosahedral proteinler olarak görülür.

HEV nanopartikülleri ve maleimid bağlantılı biyotinin tek basamaklı konjugasyonunu gerçekleştirmek için, öncelikle HEV nanopartiküllerini mini diyaliz ünitelerine uygulayın. Nanopartikülleri, üretici protokolüne uygun olarak oda sıcaklığında bir saat boyunca 0.01 molar PBS pH 7.4 ile diyalize edin. Diyalizi takiben, HEV nanopartiküllerini 1.5 mililitrelik tüplere aktarın ve bir spektrofotometre kullanarak 280 nanometrede protein konsantrasyonunu ölçün. Bir ila beş molar oran oluşturmak için, mililitre başına bir miligram nanopartikülleri, eşit miktarda 100 mikromolar maleimid-biyotin ve 0.01 molar PBS pH 7.4 ile karıştırın. Dört santigrat derecede gece boyunca reaksiyona bıraktıktan sonra, bağlanmamış maleimid biyotini üretici protokolüne uygun olarak bir spin tuzsuzlaştırma kolonu prosedürü ile uzaklaştırın. Örnekleri standart bir indirgeyici SDS page ile analiz edin.

Standart prosedürleri kullanarak, HRP-bağlı streptavidin ile kemilüminesans bir Western blot hazırlayın ve kemilüminesans sinyalini X-ışını filmi ile kaydedin.

Meme kanseri hücresine özgü ligand LXY30'un, HEV nanopartikülleri üzerindeki yüzeye açık sisteinlere iki aşamalı konjugasyonunu gerçekleştirmek için, öncelikle nanopartikülleri mini diyaliz ünitelerine yerleştirin ve oda sıcaklığında bir saat boyunca 0,01 molar PBS pH 7,4 ile diyaliz edin. Ardından HEV nanopartiküllerini 1,5 mililitrelik tüplere aktarın ve bir spektrofotometre kullanarak 280 nanometrede protein konsantrasyonunu ölçün. Sonrasında, 650 mikromolar maleimid-azid ve 650 mikromolar alkin-LXY30'u 200 mikromolar bakır sülfat ve bir milimolar askorbik asit ile birleştirin. Bu işlemle 650 mikromolar konsantrasyonda maleimid-bağlı-LXY-30 oluşturulur. Karışımı dört santigrat derece sıcaklıkta gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, bir ila üç molar oranını sağlamak için, mililitre başına bir miligram konsantrasyondaki HEV nanopartiküllerini yaklaşık %10 hacim oranında maleimid-bağlı LXY30 ile karıştırın. Dört santigrat derece sıcaklıkta gece boyunca reaksiyona bırakın. Maleimid LXY30'un nispeten yüksek konsantrasyonu nedeniyle, bakır sülfat gibi reaktantların nihai konsantrasyonları karıştırma işleminden sonra yaklaşık 10 kat azalır. Hepatit E virüsü nanopartiküllerine zarar vermesini önlemek için bir diğer seçenek, bakırsız konjugasyon yöntemidir.

Bağlanmamış maleimid click LXY30'u, üreticinin protokolüne uygun olarak bir spin tuzsuzlaştırma kolonu ile uzaklaştırın. LXY30 bağlı HEV nanopartiküllerini dört derece Celsius'ta saklayın. LXY30 HEV nanopartikülleri ve Cy5.5 floresan etiketin tek basamaklı konjugasyonunu gerçekleştirmek için, öncelikle bir ila beş molar oranını oluşturmak amacıyla, bir miligram bölü mililitre konsantrasyonundaki LXY30 bağlı nanopartikülleri eşit hacimdeki Cy5.5 floresan etiket ile karıştırın. Karışımı dört derece Celsius'ta gece boyunca reaksiyona bıraktıktan sonra, bağlanmamış Cy5.5 NHS'yi üreticinin protokolüne uygun olarak bir spin tuzsuzlaştırma kolonu işlemiyle uzaklaştırın. LXY30 Cy5.5 bağlı HEV nanopartiküllerini dört derece Celsius'ta saklayın.

Tümör hücresi hedeflemesi için HEV nanopartiküllerinin LXY30 ile fonksiyonelleştirilmesinde iki yöntem denenmiştir. HEV 573C nanopartikülleri önce maleimid azide bağlandığında ve ardından LXY30 alkin ile bir tıklama kimyası reaksiyonu gerçekleştirildiğinde, TEM gözlemi altında HEV 573C nanopartiküllerinin parçalandığı görülmüştür. Ancak, maleimide bağlı LXY30 oluşturmak için LXY30-alkin ile maleimid-azid arasında başlangıçta bir tıklama kimyası reaksiyonu gerçekleştirilmesi ve ardından modifiye edilmiş HEV nanopartiküllerine konjugasyon yapılması yapısının etkilenmediğini ve HEV 573C nanopartiküllerinin bozulmadan kaldığını göstermiştir. LXY30 ve Cy5.5 bağlı HEV nanopartikülleri, kültürlenmiş meme kanseri hücrelerine uygulanmış ve konfokal mikroskopi ile gözlemlenmiştir. Konfokal mikroskopi ile elde edilen yakın kızılötesi floresans görüntüleri, LXY30 Cy5.5 bağlı HEV nanopartiküllerinin, Cy5.5 bağlı HEV nanopartiküllerine kıyasla MDA MB-231 meme kanseri hücrelerinde artan internalizasyon için daha yüksek bağlanma afinitesine sahip olduğunu göstermektedir.

Bu tekniğin etkileri, normal hücrelere zarar vermeden tümörün doğru şekilde hedeflenmesini ve teşhis edilmesini sağlayan multimodal hedefleme ve terapötik moleküllerin incelenmesine kadar uzanmaktadır. Bu yöntem, kimyasal yüzey modülasyonu aracılığıyla kanser ve tümör hedeflemesine dair içgörüler sağlayabildiği gibi, erken kanser teşhisi, tarama ve görüntüleme güdümlü tedaviye de uygulanabilir.