Vivo içinde kalp özel gen manipülasyon farelerde Intramyocardial enjeksiyonla için basit ve etkili bir yöntem

Bu prosedürün genel amacı, yetişkin farelerde intramiyokardiyal adenovirüs enjeksiyonu ile in vivo kardiyak spesifik gen manipülasyonunu sağlamaktır. Bu yöntem, kardiyovasküler araştırma alanındaki moleküler mekanizmalar ve kardiyak hasarın hizalanması ve gen terapisinin etkinliği ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, ventilasyondan muaf olması, farelerin ameliyattan hızlı bir şekilde iyileşmesi ve tekrarlanabilir ve gerçekleştirilmesinin kolay olmasıdır.

Öyleyse şimdi başlayalım. İşlem gününde, saflaştırılmış adenovirüs vektör çözeltisini eksi 80 santigrat dereceden ısıtın, buz üzerinde saklayın. Adenovirüs çözüldüğünde, bir yüz maskesi, steril bir önlük ve steril eldivenler giyin.

Ve adenovirüs tüpüne% 75 etanol püskürtün. Virüsü steril bir laminer akış başlığına aktarın ve 50 mikrolitre virüs solüsyonunu 50 mikrolitrelik, sterilize edilmiş bir Hamilton şırıngayına aspire edin. Şırıngaya 30 gauge bir iğne takın.

Şırıngayı dik konuma getirin. İğne ucunu virüsle doldurmak için iğne ucunda bir damla çözelti görünene kadar pistonu hafifçe bastırın. Ardından, şırıngaya 30 mikrolitre daha adenovirüs solüsyonu dikkatlice aspire edin ve şırıngayı buzun üzerine yerleştirin.

Adenovirüsü bir fare kalbine enjekte etmek için, ayak parmağını sıkıştırmaya yanıt vermeyerek uygun sedasyon seviyesini onaylayın ve hayvanın gözlerine merhem sürün. Hayvanın üst göğsünü ve karnını tıraş edin. Piyasada bulunan tüy dökücü kremi açıkta kalan cilde uygulayın.

Bir dakika sonra kremi ve kalan tüyleri çıkarmak için ıslak gazlı bez kullanın. Üç iyot klorheksidin bazlı antiseptik ovma kullanarak, göğsün sol alt tarafını sterilize edin. Ardından, hayvanı cerrahi alanın üzerinde bir delik açılacak şekilde cerrahi bir örtü ile örtün ve yeni bir çift steril eldiven giyin.

Daha sonra, steril teknik ve aletler kullanarak, ksifoidden aksillaya 0,5 santimetrelik bir cilt kesisi yapın ve pektoral majör ve minör kasları künt bir şekilde incelemek için forseps ve bir Mikro Sivrisinek hemostatı kullanın. İnterkostal boşluğu ortaya çıkarmak için majör ve minör pektoral kasları geri çekin. Ve dördüncü interkostal boşluğu delmek ve açmak için Mikro Sivrisinek kanama durdurucuyu kullanın.

Kalbi kesiye doğru hareket ettirmek için baskın olmayan elin işaret parmağıyla göğüs duvarının sağ tarafına hafifçe bastırın. Daha sonra, dışsallaştırılmış kalbi aynı elin işaret parmağı ve başparmağı ile dikkatlice sabitleyin ve baskın elinizi kullanarak sol ventrikülün ventral, dorsal ve lateral duvarlarının her birinin miyokardına 10 mikrolitre adenovirüs çözeltisi enjekte edin. Son enjeksiyondan sonra, kalbi hemen intratorasik boşluğa geri getirin.

Ve intratorasik boşluktan herhangi bir havayı manuel olarak boşaltmak için göğüs duvarını insizyon bölgesine doğru hafifçe bastırın. Cildi yatay bir yatak deseninde beş ott ipek sütürle kapatın ve fareyi tam iyileşmeye kadar izleme ile 37 santigrat derecelik bir ısı yastığına yerleştirin. Ardından, kullanılmış Hamilton şırıngasını ve 30 gauge iğneyi yüksek sıcaklıkta, yüksek basınçlı sterilizatörde sterilize edin ve sterilize edilmiş iğneyi uygun bir keskin alet kabına atın.

Lusiferazı çevreleyen adenovirüsün intramiyokard enjeksiyonundan beş gün sonra, in vivo görüntüleme, özellikle kalpte lusiferazın güçlü bir aşırı ekspresyonunu gösterir ve bu, Western blot analizi ile doğrulanabilir ve hedef olmayan organ transdüksiyonunun olmadığını düşündürür. Western blot analizi ayrıca D vitamini reseptör ekspresyonunun önemli ölçüde arttığını gösterir. Ve farelerin sol ventrikülüne adenovirüs kodlayan D vitamini reseptörü enjekte edildi.

RNA D vitamini reseptörünü hedefleyen adenovirüs kodlayan kısa saç tokası enjekte edilen hayvanlarda belirgin olan reseptörün azalmış ekspresyonu ile. Buna karşılık, D vitamini reseptör ekspresyonu, her iki sol ventrikül enjekte edilen hayvanın sağ ventriküllerinde önemli ölçüde değişmemiştir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu yöntem düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse iki dakika içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü takiben, miyokard enfarktüslerinde spesifik hücre tedavilerinin etkinliği gibi ek soruları yanıtlamak için kardiyak hücre enjeksiyonu gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.