Çeviri başlatma karmaşık oluşumu memeli mRNA'ların Toeprinting analizi
10 Mayıs 2018
Vitro becerisini ölçmek için Toeprinting amaçları için formu çeviri başlatma kompleksleri ile ribozomlara koşulları çeşitli altında RNA transkripsiyonu. Bu iletişim kuralı toeprinting memeli RNA için bir yöntem açıklanır ve kap-bağımlı ve IRES uygulamalı çeviri çalışma için kullanılabilir.
Bu ayak izi analizinin genel amacı, memeli mRNA'ları üzerinde translasyon başlatma kompleksi oluşumunu gözlemlemektir. Bu yöntem, IRES aracılı çeviri başlatma gibi mRNA çevirisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, belirli bir mRNA üzerinde translasyon başlatma kompleksi oluşumunun ayrıntılı analizinin yapılabilmesidir.
XIAP IRES RNA'yı veya mutantlarını kodlayan PCR amplifiye DNA şablonlarından RNA'yı kopyalamak için transkripsiyon reaksiyonlarını birleştirin. Daha sonra, RNA'nın her 20 mikrolitrelik reaksiyonuna DNA şablonunu çıkarmak için iki birim RNaz içermeyen DNaz ekleyin. 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.
Daha sonra, DNaz ile muamele edilmiş RNA'yı nükleaz içermeyen su ile 110 mikrolitrelik bir nihai hacme seyreltin. Ardından, RNA saflaştırmasına başlamak için 110 mikrolitre asit fenol ekleyin. Numuneleri beş saniye vorteksleyin ve oda sıcaklığında üç dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüjleyin.
Fenol ekstraksiyonundan önce RNA veya CDNA'yı seyreltmek çok önemlidir. Hacim çok düşükse, sulu fazı fiziksel olarak geri kazanmak zor olacak ve nihai verim düşük olacaktır. Ardından, RNA içeren sulu fazın 100 mikrolitresini dikkatlice yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
10 mikrolitre 3 M sodyum asetat, pH 5.5 ekleyin ve numuneleri karıştırın. Ardından, RNA'yı çökeltmek için üç hacim %100 etanol ekleyin ve numuneleri beş saniye boyunca girdaplayın. Gece boyunca 20 santigrat derecede inkübe edin.
Ertesi gün, numuneleri dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Ardından, peleti 500 mikrolitre buz gibi% 70 etanol ile yıkayın ve santrifüjleme işlemini tekrarlayın. Peleti yerinden çıkarmadan mümkün olduğunca fazla süpernatanı dikkatlice aspire edin.
Sonra, peleti beş ila 10 dakika havayla kurutun. Peletleri nükleaz içermeyen suda mikrolitre başına 0,5 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona kadar yeniden süspanse edin. Ayak izi testine başlamak için, vahşi tip XIAP IRES RNA ve mutantlarını temsil eden her 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne 15 mikrolitre nükleaz ile muamele edilmemiş tavşan retikülosit lizatı ekleyin.
Her tüpe RNase inhibitörü, ATP ve GMP-PNP ekleyin. Beş dakika boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Bundan sonra, tüplerin her birine ilgili RNA'dan bir mikrolitre ekleyin ve beş dakika daha 30 santigrat derecede inkübe edin.
Kuluçka süresi boyunca, ayak izi tamponuna DTT ve spermidin ekleyin. Ardından, tüplerin her birine 22 mikrolitre parmak izi tamponu ekleyin ve 30 santigrat derecede üç dakika inkübe edin. Daha sonra, 0,5 mikrolitre IR boya etiketli ayak izi astarı ekleyin ve reaksiyonu buz üzerinde 10 dakika inkübe edin.
Daha sonra, iki mikrolitre dNTP, iki mikrolitre magnezyum asetat ve bir mikrolitre kuş miyeoloblastosis virüsü ters transkriptaz ekleyin. Parmak izi tamponu ile son hacmi 50 mikrolitreye getirin. Ardından, astar uzamasının 30 santigrat derecede 45 dakika boyunca gerçekleşmesine izin verin.
Ayak izi reaksiyonuna magnezyum asetat eklemek de çok önemlidir, bu olmadan ters transkriptaz en iyi şekilde çalışmayacaktır. Bundan sonra, 200 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin. cDNA'nın saflaştırılmasına başlamak için 250 mikrolitre 25:24:1 fenol:kloroform:izoamil alkol, pH 8.0 ekleyin.
Numuneleri beş saniye boyunca vorteksledikten sonra, numuneleri oda sıcaklığında 20.000 x g'da üç dakika santrifüjleyin. Daha sonra, DNA'yı içeren sulu fazı dikkatlice yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Ardından, DNA'yı çökeltmek ve beş saniye boyunca girdap yapmak için üç hacim% 100 etanol ekleyin.
Gece boyunca 20 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, tüpleri dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 20.000 x g'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Daha sonra, DNA peletini 500 mikrolitre buz gibi% 70 etanol ile yıkayın ve dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 20.000 x g'de santrifüjleyin.
Peleti yerinden çıkarmamaya dikkat ederek mümkün olduğunca süpernatan aspire edin. Sonra, peleti beş ila 10 dakika havayla kurutun. DNA peletini altı mikrolitre nükleaz içermeyen suda çözün.
Ardından, üç mikrolitre formamid yükleme boyası ekleyin. Ayak izi astarı ve XIAP IRES RNA'yı kodlayan DNA yapısı ile bir dideoksi nükleotid dizileme merdiveni hazırlamak için bir dizileme kiti kullanın. Daha sonra, her sıralama reaksiyonunun altı mikrolitresini üç mikrolitre formamid yükleme boyası ile karıştırın.
Plakaları temizledikten ve monte ettikten sonra jeli dökün ve tarağı yerleştirin. Jelin polimerizasyonunu takiben, sıralama aparatını monte edin ve rezervuarları 1x TBE ile doldurun. Ardından, 55 santigrat derece sıcaklığa ulaşılana kadar 15 dakika boyunca 1500 voltta önceden çalıştırın.
Tüm numuneleri formamid boya ile beş dakika boyunca 85 santigrat dereceye ısıtın. Ardından, her numuneden bir mikrolitreyi %6'lık bir poliakrilamid dizileme jeli üzerine yükleyin ve jeli sekiz saat boyunca 1500 voltta çalıştırın. Son olarak, floresan tabanlı bir görüntüleyici ile bantları gerçek zamanlı olarak okuyun.
Bu yöntem, RNA'nın doğrulanmasının translasyon başlatma kompleksi oluşumu için kritik olduğunu göstermektedir. XIAP mRNA ribozom kompleksinin ters transkripsiyonu, AUG'nin akış aşağısında 17 ila 19 nükleotid tipik ayak izleri verir. 5'PPT mutant, bozulmuş ayak izi oluşumu gösterir.
Bununla birlikte, 5'cap ile yazıya döküldüğünde, başlatma kompleksi oluşumu meydana gelir. Benzer şekilde, 3'PPT mutantı da bozulmuş ayak izi oluşumu gösterir. Bununla birlikte, 5'cap ile transkripsiyon, başlatma kompleksi oluşumuna yol açar.
Hem 5'PPT hem de 3'PPT mutasyonlarını barındıran çift PPT mutantı, 5'cap olmadan başlatma kompleksini oluşturabilir. RRL ve GMP-PNP ve bir Poly A kuyruğunun yokluğunda başlangıç kodon mutantı için ayak izi oluşumu güçlü bir şekilde bozulur. CDNA ürünleri, bir dideoksi nükleotid dizileme merdiveni ile karşılaştırılır.
İnsan beta globin veya HBB mRNA, 5'kapağın yokluğunda ayak parmağı izi göstermez. Bununla birlikte, başlatma kompleksi, HBB'nin kapaklı 5'UTR'si üzerinde oluşturulur ve AUG'nin akış aşağısında 16 ila 18 nükleotid ayak izleri verir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde yapılırsa, in vitro transkripsiyon şablonlarının ve RNA'nın hazırlanması da dahil olmak üzere üç gün içinde yapılabilir.
Bu prosedürü takiben, IRES'in vahşi tip veya mutant varyantlarının ikincil yapısı gibi ek soruları yanıtlamak için yapısal sondalama gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra bu teknik, mRNA çevirisi alanındaki araştırmacıların IRES aracılı çeviriyi in vitro olarak keşfetmelerinin yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, memeli mRNA'sının parmak izinin nasıl yapıldığını ve translasyon başlatma komplekslerinin oluşumunu analiz etmeyi iyi anlamış olmalısınız.
Asit-fenol, fenol:kloroform:izoamil alkol ve akrilamidin son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu reaktifleri kullanırken uygun kişisel koruyucu ekipman giyilmelidir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu toeprinting analizi, memeli mRNA'ları üzerinde translasyon başlatma komplekslerinin oluşumunu ölçmeyi amaçlamaktadır. Hem kap-bağımlı hem de IRES-güdümlü translasyon mekanizmaları hakkında bilgiler sağlar.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyokimya
- Moleküler Biyoloji
Arka Plan
- Toeprinting, translasyon başlangıcını incelemek için kullanılan bir tekniktir.
- mRNA'ların ribozomlarla olan spesifik etkileşimlerinin analiz edilmesine olanak tanır.
- Yöntem, IRES aracılı translasyon başlangıcını araştırmak için uygulanabilir.
- Bu süreçlerin anlaşılması, gen ekspresyonu regülasyonuna dair içgörüler elde etmek için kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- Memeli mRNA'ları üzerinde translasyon başlangıç komplekslerinin oluşumunu gözlemlemek.
- IRES aracılı translasyon başlangıcının mekanizmalarını araştırmak.
- Belirli mRNA'lar üzerindeki translasyon başlangıcının ayrıntılı bir analizini sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- PCR ile amplifiye edilmiş DNA şablonlarından RNA transkribe etmek için transkripsiyon reaksiyonları hazırlanır.
- RNA reaksiyonlarından DNA şablonunu uzaklaştırmak için RNaz-free DNaz eklenir.
- İnkübasyon 37 °C'de 30 dakika boyunca gerçekleştirilir.
- Kompleks oluşumunu değerlendirmek için toeprinting analizi yapılır.
Temel Sonuçlar
- Yöntem, translasyon başlangıç komplekslerinin oluşumunu başarıyla göstermektedir.
- IRES aracılı translasyon başlangıcına dair içgörüler elde edilmektedir.
- mRNA'ların ribozomlarla olan spesifik etkileşimleri ayrıntılı olarak analiz edilebilir.
- Teknik, translasyon başlangıcının incelenmesi için güçlü bir çerçeve sunmaktadır.
Sonuçlar
- Toeprinting, translasyon başlangıcını incelemek için etkili bir yöntemdir.
- Bu teknik, mRNA translasyon mekanizmalarının anlaşılmasını geliştirir.
- Translasyon dinamiklerini araştırmak amacıyla çeşitli mRNA'lara uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörle İlgili Yönetici Özeti
Toeprinting analizi, protein sentezi regülasyonunda kritik bir kontrol noktası olan translasyon başlama mekanizmalarının hassas bir şekilde incelenmesini sağlar. Bu yöntem, kap bağımlı ve IRES aracılı translasyona dair uygulanabilir veriler sunarak, erken keşif aşamasındaki hedef doğrulaması ve mekanistik risk azaltma süreçlerine doğrudan bilgi sağlar. Düzenleyici elementleri ve ribozom etkileşimlerini ayrıştırma yeteneği, hastalıkla ilgili sistemlerde portföy önceliklendirmesi için öngörü güvenilirliğini destekler.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Ribozomların spesifik mRNA dizilerine ve yapılarına bağlanmasının doğrudan değerlendirilmesine olanak tanır.
- IRES gibi düzenleyici elementlerin translasyon başlatma üzerindeki fonksiyonel etkisini açıklığa kavuşturur.
- Kep-bağımlı ve kep-bağımsız başlatma yollarını birbirinden ayırarak mekanistik risk azaltmayı destekler.
- Hastalık durumlarıyla ilgili translasyonel kontrol noktalarının hipotez odaklı doğrulanmasını kolaylaştırır.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Belirlenmiş koşullar altında translasyon başlangıç kompleksinin oluşumunu nicelleştirmek için valide edilmiş bir sistem sağlar.
- Mutant ve yabanıl tip mRNA'ların ribozomlarla etkileşimlerinin tekrarlanabilir ölçümüne olanak tanır.
- Translasyon modülatörlerinin sonraki aşamalardaki taramaları için analiz standardizasyonunu destekler.
- Bileşik değerlendirmesine ve mekanistik taramaya temel oluşturacak nicel çıktılar sunar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Stres yanıt translasyon mekanizmalarını sorgulayarak hastalıkla ilgili modellerle uyum sağlar.
- Moleküler keşiften, translasyonel regülasyonun preklinik doğrulamasına kadar olan sürekliliği destekler.
- RNA regülatör elementlerinin translasyonel etkisini netleştirerek riskle uyumlu ilerlemeye olanak tanır.
- Translasyon tabanlı müdahaleler için biyobelirteç geliştirilmesine temel oluşturacak mekanistik veriler sağlar.
İş Akışı ve Süreç Entegrasyonu
Toeprinting, moleküler mekanizmanın aydınlatılması ile translasyon hedefli programlar için assay geliştirme arasında köprü kurarak, erken keşiften öncü bileşik tanımlama sürecine kadar olan süreklilik içerisinde konumlanır.
- Keşif Biyolojisi: Translasyon başlatma mekanizmaları ve düzenleyici element fonksiyonlarının hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Translasyon başlatma kompleksi oluşumu için tekrarlanabilir, kantitatif okumalar sağlar.
- Analitik: Yabanıl tip ve mutant mRNA translasyon başlatma verimliliğinin doğrudan karşılaştırılmasına olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Moleküler bulguları, hastalıkla ilgili translasyon kontrolü ve stres yanıt yolaklarıyla ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Farklı programlar genelinde çeşitli mRNA ve düzenleyici elementlerin incelenmesi için yeniden kullanılabilir bir platform görevi görür.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hedef doğrulamasındaki öngörü güvenini artırır ve translasyon kontrolündeki mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Ar-Ge ekipleri arasında tekrarlanabilirlik ve ölçeklenebilirlik için translasyon başlatma analizlerini standartlaştırır.
- Stratejik Değer: Translasyonel düzenlemeyi netleştirerek ve sermaye açısından verimli portföy ilerlemesini destekleyerek devam/dur kararlarına temel oluşturur.
- Portföy Etkisi: Translasyonel kontrol verilerine dayanarak hedeflerin ve mekanizmaların riskle uyumlu önceliklendirilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- RNA işlemleri, in vitro transkripsiyon ve ribozom kompleksi kurulumunda uzmanlık gerektirir.
- Özel reaktiflere, floresan görüntülemeye ve sekanslama altyapısına erişim gerektirir.
- Tekrarlanabilir toeprint kantifikasyonu için ekipler arası titiz bir standardizasyon gereklidir.
- Farklı mRNA şablonları veya düzenleyici element bağlamları için adaptasyon gerekebilir.
- Güvenilir çıktılar için tehlikeli reaktiflerin dikkatli kullanımı ve reaksiyon koşullarının optimizasyonu esastır.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:04
Title
0:34
Preparation of mRNA
2:59
Toeprinting Assay
6:32
Sequencing Reactions and Gel Electrophoresis
7:53
Results: Importance of IRES Secondary Structure in the Formation of Translation Initiation Complexes on an Uncapped XIAP IRES RNA
9:35
Conclusion
